金属锌对糖尿病大鼠视网膜血管黏附分子-1表达的影响

刘卫东 孙珉丹 董 宇 梁玲玲

(吉林大学白求恩第一医院眼一科，吉林 长春 130021)

糖尿病性视网膜病变(Diabetic Retinopathy，DR)是以新生血管形成为特点的糖尿病常见而严重的微血管并发症，是50岁以上患者重要的致盲原因，病程10～14年的糖尿病患者26%发生DR，病程15年以上者63%发生DR，DR晚期严重损害视力可造成不可逆盲，所以及时治疗至关重要。目前对DR的治疗包括激光光凝、玻璃体切除及药物治疗，各种治疗方法各有利弊。本文探讨金属锌对DR的防治作用，为临床治疗及用药提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物和试剂 健康成年雄性Wistar大鼠36只，体质量180～220 g，高脂饲料组成:普通基础饲料88.8%，猪油10%，胆固醇1%，胆盐0.2%，均由吉林大学白求恩医学部基础医学院实验动物中心提供。链脲佐菌素(Streptozocin，STZ)购自Sigma公司，4℃保存，使用前用新配制的0.1 mol/L柠檬酸缓冲液在水浴下配制成2%STZ溶液，调至pH4.4，现配现用;硫酸锌购自北京精求化工责任有限公司，使用前配制成2%的硫酸锌溶液备用;VCAM-1多克隆抗体购于武汉博士德生物有限公司，胆固醇、胆酸购于上海惠世生化试剂有限公司;血糖试纸购于泰尔茂医疗产品(上海)有限公司;血脂、尿糖试剂购于长春汇力公司。

1.2 动物模型的建立及分组 将36只Wistar大鼠，均适应性饲养1W，随机分为(1)正常对照组(2)高脂组(3)高脂+锌组(4)STZ+高脂组(5)STZ+高脂+锌组(6)STZ+高脂+后加锌组，正常对照组使用普通基础饲料喂养;其余各组均以高脂饲料喂养，喂养4 w后，高脂+锌组每日硫酸锌30 mg/kg灌胃;STZ+高脂组、STZ+高脂+锌组、STZ+高脂+后加锌组的大鼠禁食12 h，以STZ(用0.1 mol/L枸橼酸钠缓冲液稀释STZ至2%浓度，pH4.4)40 mg/kg 5 min内腹腔注射，以空腹血糖＞16.8 mmol/L，尿糖()以上，尿量及饮水明显增多定为高糖血症，建立STZ糖尿病大鼠模型。同时STZ+高脂+锌组大鼠每日给予硫酸锌30 mg/kg灌胃;STZ+高脂+后加锌组在建立STZ糖尿病大鼠模型后3 d每日给予硫酸锌30 mg/kg灌胃;正常对照组及高脂组均每日给予等量生理盐水灌胃。实验期间所有大鼠正常饮食水，定期测血糖、尿糖及体重。4 w后各实验组断尾测血糖，轻摘眼球，取视网膜组织进行免疫组化。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化方法 免疫组织化学染色采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法(S-P法)，其操作步骤如下:(1)切片常规脱蜡、脱水。(2)PBS冲洗5 min。(3)3%H2O2-蒸馏水阻断内源性过氧化物酶25 min。(4)PBS冲洗5 min，3次。(5)抗原修复。(6)山羊血清(1∶20)封闭30 min。(7)特异性一抗(VCAM-1多克隆抗体)于切片上，孵育40 min。(8)PBS冲洗5 min，3次。(9)滴加相应的二抗(IgG或Biotin)，孵育40 min。(10)PBS冲洗5 min，3次。(11)加相应的三抗(S-A/HRP)孵育40 min。(12)PBS冲洗5 min，3次。(13)DAB-蒸馏水溶液显色。(14)Mayer苏木精复染，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.3.2 免疫组化结果 应用计算机图像处理技术测定视网膜组织VCAM-1表达量的累积光密度(integrated optical density，IOD)，并采用Imagepro-Plus软件进行数据分析。

1.4 统计学分析 采用SAS9.0统计学软件包进行数据统计分析，多组比较采用单因素方差分析，再进行两两比较。

2 结果

正常对照组，高脂组，高脂+锌组，STZ+高脂组，STZ+高脂+锌组，STZ+高脂+后加锌组视网膜组织中VCAM-1表达水平分别为 4 960.42±3 180.97、20 776.74±12 176.17、10 388.57±1 275.22、24 273.05 ±5 102.10、15 212.52 ±5 073.17、6 846.95±1 249.94。见图1。高脂组，高脂+锌组，STZ+高脂组，STZ+高脂+锌组，STZ+高脂+后加锌组视网膜组织中VCAM-1的表达与正常对照组比较均增高(F=10.07，P＜0.000 1);高脂+锌组视网膜组织中VCAM-1的表达与高脂组比较降低，且差异具有统计学意义(P＜0.05);STZ+高脂+锌组，STZ+高脂+后加锌组视网膜组织中VCAM-1的表达与STZ+高脂组比较降低，且差异具有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

图1 各组视网膜组织VCAM-1表达(免疫组化，×400)

3 讨论

DR基本病理基础是视网膜微循环异常，毛细血管内皮细胞的基底膜增厚，自动调节功能障碍，乃至毛细血管闭塞，视网膜缺血、缺氧，新生血管形成。氧化应激增多是已经被公认的DR发病的基础机制，其来源包括自由基增多和氧化防护组织破坏增多〔1〕，而自由基增多也与炎症反应密切相关，近年很多文献报道认为炎症反应与DR的发病也密切相关，是DR的发病机制之一〔2〕。金属硫蛋白可以清除氧自由基，是保护细胞和组织免受氧化应激损伤的抗氧化物，金属锌可以诱导金属硫蛋白在细胞和组织中的表达，从而发挥抗氧化作用及抗炎作用，以减少新生血管的形成〔3〕。Moriarty-Craige等人的动物实验表明补锌可以预防及治疗糖尿病心肌病〔4〕。Tate等〔5〕的研究也发现补锌可以抑制年龄相关性黄斑病变的发生，降低年龄相关性黄斑病变患者丧失视力的可能性。氧化应激增多，血管通透性增加，血管内皮细胞开始变薄，细胞因子释放增多VCAM-1等血管内皮活化物表达随之增加，而VCAM-1表达增加与新生血管形成密切相关〔6，7〕，有文献报道DR的患者VCAM-1的表达增加，能够促进DR的发生发展〔8〕。试想金属锌是否可以通过抗氧化作用及抗炎作用降低VCAM-1的表达，从而减少新生血管的形成，达到延缓 DR发生发展的作用，所以本文选择VCAM-1作为我们实验的观察指标，观察金属锌是否能够通过抑制VCAM-1的表达达到抑制DR的发生发展，较多国外文献也报道过VCAM-1可以很好的作为评价DR合适的标记物〔8〕，本研究中高脂组，高脂+锌组，STZ+高脂组，STZ+高脂+锌组，STZ+高脂+后加锌组视网膜组织中VCAM-1的表达均比正常对照组高，且具有显著的统计学意义，高脂+锌组中视网膜组织中VCAM-1的表达比高脂组低，且具有统计学意义，STZ+高脂+锌组，STZ+高脂+后加锌组视网膜组织中VCAM-1的表达比STZ+高脂组低且具有统计学意义，表明金属锌可以降低糖尿病大鼠视网膜组织中VCAM-1的表达，而且还可以降低高脂组大鼠视网膜组织中VCAM-1的表达，其抑制炎症反应的可能机制是通过金属锌对氧化应激的抑制作用，进一步目的抑制炎症反应的发生，达到延缓糖尿病视网膜病变发展的。

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4 Moriarty-Craige SE，Ha KN，Sternberg P，et al.Effects of long-term zinc upplementation on plasma thiol metabolites and redox status in patients with age-related macular degeneration〔J〕.Am J Ophthalmol，2007;143:206-11.

5 Tate DJ，Newsome DA.A novel zinc compound(zinc monocysteine)enhances the antioxidant capacity of human retinal pigment epithelial cells〔J〕.Curr Eye Res，2006;31(7-8):675-83.

6 Nowak M，Wielkoszyński T，Marek B.Blood serum levels of vascular cell adhesion molecule(sVCAM-1)，intercellular adhesion molecule(sICAM-1)and endothelial leucocyte adhesion molecule-1(ELAM-1)in diabetic retinopathy〔J〕.Clin Exp Med，2008;8(3):159-64.

7 Khalfaoui T，Lizard G，Beltaief O，et al.Immunohistochemical analysis of cellular adhesion molecules(ICAM-1，VCAM-1)and VEGF in fibrovascular membranes of patients with proliferative diabetic retinopathy〔J〕.preliminary study〔J〕.Pathol Biol，2009;57(7-8):513-7.

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