康脑液2号对局灶性脑缺血再灌注大鼠的治疗作用及其机制

梁起保 薛 茜 赵秀芳 石会娟 邹玉安

(河北北方学院，河北 张家口 075000)

脑血管疾病是我国位居第三的致死因素，其中缺血性脑血管病(ICVD)可占56.6% ～80%，患者总人数可达(500～600)万，存活者有约75%的高致残率〔1〕。本实验通过观察经验方康脑液2号对脑缺血再灌注(I/R)大鼠的治疗作用，并从促血管新生的角度研究其治疗机制，为其防治ICVD提供理论依据，也为补气活血法治疗老年脑梗死提供依据。

1 材料与方法

1.1 药品及试剂 康脑液2号:黄芪、当归、川芎、三七、葛根、地龙、丹参、钩藤(后下)等组成(购于河北北方学院第一附属医院)。冷水浸泡一夜，煎煮2次，滤出药渣，将2次煎取的药液混匀，文火分别浓缩成400%、200%、100%康脑液2号(每 ml含生药 4、2、1 g)，4℃冰箱保存。多聚甲醛(购自美国Sigma公司)。MCAO栓线(北京沙东)，兔抗大鼠 Ang-1、VEGF、CD105一抗体及相应二抗(武汉博士德公司)。

1.2 主要实验仪器 电脑生物组织包埋机(浙江金华科迪)，石蜡切片机(美国Thermo)，电脑生物组织摊烤片机(浙江金华科迪)，光学显微镜(日本OLYMPUSBX60型)，显微摄影装置(日本NIKON)，自动脱水机(美国Thermo)。

1.3 实验动物分组及给药 SPF级雄性SD大鼠150只，体重200～280 g，购自北京大学医学部动物中心〔许可证号SCXK(京)2006-0008〕。随机分为:假手术组、模型组、康脑液2号高(28.6 g·kg－1·d－1)、中(14.3 g·kg－1·d－1)、低(7.15 g·kg－1·d－1)剂量组，每组24只，手术组缺血2 h，从手术后12 h开始灌胃给药，每天1次，直至处死。给药剂量按大鼠与人体表面积等效剂量折算，假手术组及模型组灌胃等体积生理盐水。根据改良Longa方法，线栓经右侧颈外动脉插线建立右侧大脑中动脉阻塞(MCAO)法制作大脑I/R模型。

1.4 大鼠神经功能评分 参照Longa 5分制评分方法对各个实验动物的神经行为学进行评分。分别于大鼠苏醒时及I/R 24 h后进行评分:0分，无神经系统损伤症状;1分，不能完全伸展对侧前爪;2分，向左侧转圈;3分，向对侧倾斜;4分，不能自发行走，意识丧失。

1.5 HE染色及VEGF、Ang-1蛋白检测 于再灌注每个时间点，取每组另外6只大鼠，10%水合氯醛(300 mg/kg)ip麻醉，经左心室插管至升主动脉，依次灌入生理盐水150 ml、4%多聚甲醛200 ml前固定至肢体变硬，开颅取脑，于前囟前2 mm至前囟后3 mm切脑，切块厚度5 mm，置入4%多聚甲醛中后固定12～24 h，常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋。切片3μm，HE染色观察脑梗后病理变化，采用免疫组织化学(SP二步法，按说明操作)检测VEGF及Ang-1蛋白表达。

1.6 血管密度检测 免疫组织化学方法标记CD105显示新生血管，步骤同上。切片经图像分析仪分析系统处理，参照Weidner法〔2〕进行微血管密度(MVD)计数，每份标本均选5个高倍视野(200×)计数微血管数目后取平均值为平均微血管数(MMVC)，以 MMVC/mm2表示 MVD(200×/高倍视野等于0.042 6 mm2)。

1.7 统计学处理 采用SPSS16.0软件，数据以x±s表示，采用单因素方差分析(ANOVA)，组间两两比较用SNK法。

2 结果

2.1 各组神经功能评分比较 与假手术组比较，模型组大鼠神经功能行为评分显著升高(P＜0.01);与模型组比较，康脑液2号治疗组大鼠显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，但是显著高于假手术组，康脑液2号高中剂量组显著低于低剂量组(P＜0.05)，但高中剂量两组无显著差异(P＞0.05)，见表1。

2.2 各组大鼠HE改变 光镜下可见模型组梗死明显，梗死主要位于基底节、皮质下白质和皮层，缺血区神经细胞明显减少，残存神经细胞胞体缩小变性，细胞核固缩，胞质深伊红染色，神经元纤维疏松，间质水肿明显，血管减少。康脑液2号治疗组可见梗死范围缩小，水肿程度也较轻，神经元形态改变较轻，胞体完整，突起较清楚，基本保持完整。血管较模型组明显增多。见图1。

表1 各组大鼠神经功能评分(n=24)和脑血管密度(n=6，血管数/mm2)比较(x±s)

图1 各组大鼠脑病理改变(HE，×100)

2.3 脑组织VEGF及Ang-1免疫组化结果 VEGF及Ang-1阳性表达可见胞质呈棕黄色，可表达于神经细胞、胶质细胞及血管内皮细胞。与假手术组相比，模型组VEGF及Ang-1蛋白表达显著增强(P＜0.05或P＜0.01)。和模型组相比，康脑液2号治疗组VEGF及Ang-1表达显著增高(P＜0.05或P＜0.01)，不同的是，VEGF表达高峰在7 d，Ang-1表达高峰在14 d。康脑液2号高、中剂量治疗组之间无显著差异，但结果都明显高于低剂量组(P＜0.05)。见表2及图2。

图2 各组大鼠VEGF、Ang-1和血管表达的比较(免疫组化，×400)

2.4 大鼠脑组织血管密度结果 空白组及假手术组阳性血管表达较少，模型组血管密度显著高于空白组(P＜0.01)，与模型组相比，康脑液2号各治疗组血管密度显著增高(P＜0.05或P＜0.01)，康脑液2号高中剂量组促血管新生能力显著强于低剂量组(P＜0.05)，见表1及图2。

表2 各组大鼠VEGF和Ang-1的比较(×400，x ±s，个数/视野，n=6)

3 讨论

脑缺血缺氧后出现一系列变化，包括炎症反应、自由基超载、毒性氨基酸释放等，神经功能和脑组织病理改变是最直接客观的改变。但脑缺血缺氧的一系列改变归根结底是脑组织缺血导致，如果能及时恢复血供无疑是治疗脑缺血的主要手段。临床工作中早期T-PA溶栓显示较好的临床效果证实了这一点。但T-PA溶栓指征苛刻，临床上适合溶栓的病人非常少，研究一种能促进脑缺血周围组织血管新生的方法成为治疗ICVD的重要策略。近几年，科学家们研究了各种治疗性血管新生，包括细胞疗法、蛋白疗法等，但不仅价格昂贵，安全性也不可靠，中药凭借其多靶点、副作用小、经济便宜等优点成为了促血管新生的研究重点。

血管新生是在缺血组织已有的血管床上，内皮细胞以牙生方式长出新支，形成血管网使其功能与局部需要相适应的生物学过程，主要靠促血管新生因子来促其生成。VEGF是迄今发现最重要一种促血管生成因，一方面能高选择地促进血管内皮的有丝分裂，进而促进血管内皮新生;另外，其还能增加血管内皮通透性，使血浆大分子物质渗透到血管的基质中，从而为新的血管提供营养物质〔2〕。Ang-1在血管新生过程中发挥着重大作用，主要机制如下:①使血管内皮细胞趋化、聚集，吸引周细胞形成新生血管;②拮抗内皮细胞凋亡;③促进血管内皮细胞迁移和形成管状结构，加强VEGF等血管稳定作用;④调节内皮细胞和血管平滑肌细胞，促进血管重塑、成熟，维持血管的完整性和稳定性〔3〕。CD105不与大血管内皮细胞反应，但对新生血管反应性强，即与“活化”的内皮细胞反应性强，而对组织中正常的静止状态下的血管内皮细胞反应性差〔4〕。本实验选择VEGF、Ang-1、CD105作为观察血管新生的指标更有说服性。

ICVD隶属中医中风范畴，“素体气虚，不能行血，以致血瘀”是其主要发病理论，补气活血法能够“行气通脉、活血化瘀”，是老年性脑梗死的主要治法。康脑液2号是临床使用多年的经验方，适合气虚血瘀患者，由补气活血的鼻祖方补阳还五汤按照现代人的特点化裁而来，君以大量黄芪大补脾胃元气，使得气旺血行，瘀去络通，并且活血祛瘀而不伤正。当归善于活血养血，有化瘀而不伤血之妙，并和黄芪1:5配伍为当归补血汤，充养脉络，是为臣药。川芎、葛根、地龙、三七、丹参等助当归活血化瘀，为佐药。钩藤、天麻引药上行，是为使药，君臣佐使共奏补气活血化瘀之功。补气活血法促血管新生研究颇多，田兆华〔5〕等实验证实补阳还五汤能明显增多缺血脑组织新生血管数目。刘清君等〔6〕明确了当归补血汤有明显的促血管新生作用。其余各药对脑梗死的治疗作用均有研究，有的已经在临床使用，比如川芎、丹参、葛根等。

综上，康脑液2号对脑I/R发挥较好的治疗作用，其机制可能是其促进VEGF、Ang-1等促血管新生因子的表达，而使缺血周围区域血管新生增加。

1 Jia Q，Liu LP，Wang YL.Stroke in China〔J〕.Clin Exp Pharmacol Physiol，2010;37(2):259-64.

2 Wang YQ，Guo X，Qiu MH，et al.VEGF overexpression enhances striatal neurogenesis in brain of adult rat after a transient middle cerebral artery occlusion〔J〕.JNeurosci Res，2007;85(1):73-82.

3 刘 帅，刘学政.Ang-1/Tie2系统与病理性血管形成的关系〔J〕.解剖科学进展，2010;16(1):85-8.

4 于建宪，常 宏，纪 萍.CD105、CD34及Ⅷ因子在不同生理状态下子宫内膜中的表达〔J〕.齐鲁医学杂志，2005;20(3):189-91.

5 田兆华，刘柏炎.补阳还五汤对局灶性脑缺血大鼠血管新生的影响〔J〕.中国动脉硬化杂志，2010;18(3):193-8.

6 刘清君，李应东，刘彩梅，等.当归补血汤超滤膜提取物对鸡胚绒毛尿囊膜血管新生的影响〔J〕.中西医结合心脑血管病杂志，2008;6(4):420-1.