碎米荠醇沉多糖的共沉淀物分离纯化

杨大伟，钟菊英

(湖南农业大学 食品科学技术学院，湖南 长沙 410128)

碎米荠是一种具有多种药用功能的十字花科植物[1]，碎米荠多糖也拥有多种生理功能[2].在碎米荠多糖分离纯化过程中，乙醇沉淀多糖时，一种未知有机物与多糖一起被沉淀(共沉淀物)，这种共沉淀物必须与结合的多糖有效分离，才能最大程度地将碎米荠多糖提取出来，增加多糖的得率.

1 材料与方法

1.1 材料

1)试验材料：碎米荠粗多糖溶液(实验室制取).

2)主要试剂与药品：甲醇，苯酚，浓硫酸，丙酮，磷酸氢二钠，以上试剂均为分析纯.

3)主要仪器与设备：琼脂糖(sepharose) 6B凝胶层析柱，大孔树脂(AB-8)吸附层析柱，高效液相色谱仪(D10NEX 美国)，泵：P680 HPLC pump 四元梯度泵，柱温箱：TCC-100，检测器：二极管陈列检测器PDA-100，冷冻离心机，723紫外-可见分光光度计.

图1 共沉淀物洗脱曲线

图2 共沉淀物的琼脂糖Sepharose 6B凝胶层析

1.2 方法

1.2.1 碎米荠粗多糖与共沉淀物的分离方法 乙醇沉淀的碎米荠粗多糖经蒸馏水溶解后，向溶液中加入磷酸氢二钠等无机盐将结合在多糖上的共沉淀物絮凝沉淀，离心后，收集沉淀，上清液加入磷酸氢二钠絮凝共沉淀物，反复上述操作到上清液加入磷酸氢二钠无絮凝现象，保留上清液供后续多糖纯化使用，合并沉淀，将沉淀用适量的蒸馏水溶解.向溶液中加入丙酮，由于共沉淀物是依靠氢键等弱作用力与多糖结合的，采用丙酮等有机溶剂可将氢键等弱作用力破坏，从而实现多糖与共沉淀物的分离.丙酮沉淀的多糖与共沉淀物再用蒸馏水溶解，溶液又用磷酸氢二钠絮凝沉淀，离心后，收集上清液，沉淀经蒸馏水溶解，如此反复将沉淀溶解、丙酮沉淀、磷酸氢二钠絮凝，直到共沉淀物经硫酸-苯酚法检测呈阴性为止，分别收集上清溶液和共沉淀物，共沉淀物进一步纯化，上清液供后续多糖纯化使用.

1.2.2 共沉淀物的纯化方法 ①将一定浓度的样品40 mL上大孔树脂柱，以流速1.2 mL/min进行动态吸附，再用浓度梯度30%～80%的甲醇以流速2.5 mL/min通过树脂床进行洗脱，层析仪自动绘制洗脱曲线[3].洗脱液备用供进一步用琼脂糖sepharose 6B凝胶层析对共沉淀物进行纯化;②用琼脂糖sepharose 6B凝胶层析对共沉淀物进行纯化，方法是：以湿法在搅拌下将琼脂糖sepharose 6B凝胶加入到玻璃层析柱(20×400 mm)中，等凝胶沉降后再将水放出，用蒸馏水充分洗涤层析柱，备用.小心地将真空浓缩并透析后的共沉淀物样品(3 mL)滴加到层析柱中，让样品液过柱恰好与凝胶介质顶端平齐，再用适量的蒸馏水洗涤，让洗涤液过柱恰好与凝胶介质顶端平齐，最后用蒸馏水洗脱，控制洗脱流速为1.5 mL/min，层析仪自动绘制洗脱曲线.

1.2.3 共沉淀物的纯度鉴定方法 ①在紫外区对共沉淀物溶液进行全波长扫描，确定其特征吸收波长;②高效液相色谱法鉴定共沉淀物纯度，采用人工进样，双蒸馏水洗脱，柱温30℃，流速1.0 mL/min.

2 结果与分析

2.1 大孔树脂分离共沉淀物的结果

以洗脱时间为横坐标，洗脱液中共沉淀物的光密度为纵坐标，层析仪自动绘制洗脱曲线，如图1所示.用浓度30%～80%的甲醇梯度洗脱时，得到一个共沉淀物组分.

2.2 共沉淀物的琼脂糖(Sepharose) 6B凝胶层析结果

用琼脂糖(Sepharose) 6B对被大孔树脂纯化的共沉淀物进行凝胶层析，结果如图2所示.

从图2的层析结果可以看出，根据分子量的大小，碎米荠共沉淀物包括两个组分，由于Sepharose 6B分离物质的分子量范围在104～4×106之间[4]，而且这两个组分的洗脱时间也较快，所以上述两个共沉淀物组分的分子量在104～4×106之间；第一个共沉淀物组分的洗脱量较低，后续的进一步纯化，尤其是制备工作的难度较大，故没有做进一步分析，而是选择第二个共沉淀物组分做进一步的纯度鉴定.

2.3 碎米荠共沉淀物的纯度鉴定结果

1)共沉淀物检测波长的扫描结果 用紫外-可见分光光度计对共沉淀物溶液进行扫描，扫描结果如图3所示.

图3 共沉淀物样品的波长扫描

图4 共沉淀物在280 nm处的高效液相色谱

从图3可见，共沉淀物最大吸收波长在紫外区，可以进一步高效液相色谱法鉴定碎米荠共沉淀物的纯度.

2)高效液相色谱法鉴定碎米荠共沉淀物的纯度时，选择波长280 nm进行检测，检测结果如图4所示.

高效液相色谱法鉴定结果表明，共沉淀物的纯度达到色谱纯.

3 讨论与小结

3.1 大孔树脂对共沉淀物的吸附特性

大孔树脂吸附层析是基于大孔吸附树脂对欲分离物质的吸附作用和分子筛作用进行分离纯化的[5].从共沉淀物的质谱碎片分子结构可知，共沉淀物具有酮基和羧酸酯等极性基团，因而大孔树脂对共沉淀物表现出吸附性.

3.2 共沉淀物的浓度不同其大孔树脂柱层析条件会有所变化

虽然本文对大孔树脂分离共沉淀物的层析行为特征和条件进行了探讨，但实际研究中共沉淀物的浓度不同，大孔树脂的柱层析行为会有所变化，尤其是其层析条件会发生较大的变化，所以本文的大孔树脂柱层析条件是在特定的共沉淀物浓度下得到的.尽管如此，本文的研究结果对大孔树脂柱分离纯化共沉淀物仍有一定的参考作用.

综上所述，以碎米荠粗多糖液为试验材料，用磷酸氢二钠和丙酮反复处理共沉淀物把共沉淀物与多糖分离；然后用大孔树脂吸附层析对共沉淀物进行纯化，层析条件是：一定浓度的样品40 mL上柱，以流速1.2 mL/min进行动态吸附，再用浓度30%～80%的甲醇以流速2.5 mL/min通过树脂床进行梯度洗脱；最后用琼脂糖Sepharose 6B(20×400 mm)凝胶过滤层析将共沉淀物分离为两个组分，层析条件是：上样量3 mL，蒸馏水洗脱，控制洗脱流速为1.5 mL/min.纯化的共沉淀物纯度为高效液相色谱纯.

参考文献:

[1]刘合刚，费新贵，陈林.华中碎米荠的生物药学研究[J].时珍国药研究,1993,5(3):14-15.

[2]Vliegehthart J F G.Abstract of the 12th International Carbohydrate Symposium[J]. Netherlands:Vonk Publishers,2002:566.

[3]高荣海,李长彪,刘长江,等.大孔吸附树脂对大豆异黄酮吸附性能的研究[J].食品工业科技, 2006,27(10):49-51.

[4]赵永芳.生物化学技术原理及其应用[M].武汉：武汉大学出版社，1995:120-121.

[5]汪茂田,谢培山,王忠东,等.天然有机化合物提取分离榆结构鉴定[M].北京：化学工业出版社,2004:100-101.