由Id1介导的MMP-2、MMP-9对胃癌生成的调控作用

雷婷 韩霜 郭雪艳 丁杰

1.兰州军区乌鲁木齐总医院消化病中心，新疆 乌鲁木齐 830000；

2.第四军医大学西京医院消化病院，全军消化病研究所肿瘤生物学国家重点实验室，陕西 西安 710032；

3.陕西省人民医院消化内科，陕西 西安 710068

肿瘤的发生与维持离不开新生血管的形成，肿瘤细胞的侵袭更依赖于肿瘤内新生血管向远处转移。寻找一个合适新生血管的靶标，是治疗肿瘤的关键。目前认为分化抑制因子1(inhibitor of differentiation 1，Id1)是一种准原癌基因的侯选分子和促血管生成因子，多项研究提示其表达在肿瘤的血管生成过程中可能起着重要作用［1］。Id是螺旋-环-螺旋(HLH)转录因子亚家族的一个成员，通过影响其下游分子的转录而发挥作用［2］，但其参与血管生成的具体机制尚不明确。

随着互联网与社交媒体技术的日益普及，弹幕视频引起了人们的兴趣与关注。弹幕视频之所以能够媲美甚至超越传统视频，其中一个最突出的差异就是评论的即时反馈性。传统的评论由于留言在视频下方，通常在一定时间差之后才会收到回复，但通过弹幕视频系统发布到视频播放的画面上，受众能够在观看视频的同时进行在线评论。这种沟通不存在反馈的时间差问题，更加接近于即时反馈。

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是细胞外基质(extracellular matrix，ECM)和基底膜重塑所必需的条件，目前认为MMPs并不仅仅只降解ECM成分，其更多的是作用于血管的发生。MMPs几乎在所有的人类肿瘤中广泛而大量表达，大量研究证实MMPs的高水平表达与肿瘤的侵袭和(或)转移能力以及不良预后有关，并在肿瘤的血管生成中起着决定性作用［3］。有报道提出，在Id1基因敲除的鼠胚胎纤维母细胞的培养上清中MMP-2的活性下降［4］。本研究着重探讨了Id1通过调控MMPs发挥促胃癌生成的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

Id1兔多克隆抗体为Santa Cru z 公司产品；MMP-2、MMP-9兔多克隆抗体为Sigma公司产品；β-actin鼠单抗为Sigma公司产品；细胞总RNA提取试剂TRIzol购自Invitrogen公司；Id1、MMP-2和MMP-9引物根据软件设计由北京三博远志生物工程技术有限公司完成；一管便携式PCR扩增试剂盒(2×Taq PCR Mastermix)购自北京天为时代公司；SABC试剂盒和DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；HRP标记羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；逆转录反应

试剂盒购自MBI Ferments公司；焦碳酸二乙酯(DEPC)和溴化乙锭(EB)购自Sigma公司；醋酸纤维素(NC)膜购自Hybond公司；蛋白分子量蛋白质标准来自MBI Ferments公司；RPMI1640培养基购自Invitrogen公司；胰蛋白酶购自Hyclone公司；胎牛血清购自四季青公司；小量质粒提取试剂盒购自Omega公司；脂质体LipofectmineTM2000购自Invitrogen公司；BamHⅠ、Hind Ⅲ、kpnⅠ和Hind Ⅲ酶购自Takara公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学检测

经Western blot和RT-PCR检测可见，在Id1低表达的细胞中MMP-2和MMP-9的蛋白水平(图3)及mRNA水平(图4)均下调，同时Id1抑制效率越高，MMP-2、MMP-9的表达越低。

1.2.2 Id1特异性siRNA的设计

用胰酶消化处于对数生长期的细胞，制成细胞悬液。通过裸鼠皮下注射0.2 mL的细胞悬液，8周后处死裸鼠。取出移植瘤，进行移植瘤连续切片，HE染色观测肿瘤形态。

1.2.3 siRNA表达载体的构建

合成编码发夹结构siRNA的正义链和反义链，分别取5 μL正反义寡核苷酸，20 μL 2×退火缓冲液，加入10 μL去离子水于95 ℃水浴中5 min。将退火后的双链siRNA与酶切纯化的pSilencer3.1载体于16 ℃连接过夜。以连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞，在氨苄青霉素抗性平板上筛选重组载体。扩增白色的抗性菌落并提取质粒，以BamHⅠ和HindⅢ酶切鉴定重组质粒。收集酶切鉴定正确的重组质粒，送上海生工公司进行DNA全长自动测序。

我在清代笔记中发现一个有趣的故事，说乾隆年间江苏宜兴有人研究老虎后，熬制了黏胶撒在老虎常常打滚的草丛里，而老虎爱干净（这一点很像猫咪），不能忍受毛皮沾草，就舔啊舔，最终舔得烦躁，暴躁死掉。然后这个人就能比武松更轻松地获得一只老虎。

用Origin7.5统计学软件进行统计分析。定量资料实验结果以表示，均数间的比较采用t检验；率的比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

按照LipofectamineTM2000 Reagent脂质体转染说明转染人胃癌SGC7901细胞。转染前1天，将细胞接种于6孔板，约3×105/孔，待细胞达到80%融合。DNA定量后取2 μg，LipofectamineTM2000 5 μL，加无血清培养基500 μL。转染6 h后，换含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养。

这个事件早在之前朋友圈发酵，甚至有人因此怀疑WSET认证的价值是否不如从前。单靠一纸证书是否能够全面地去了解一位从业者的知识能力水平？David Allen MW表示：“WSET 4级是一项非常认真严肃的考试，而且整个课程经过了极大的改进，比25年前的文凭课程要困难得多。如果越来越多的中国人通过WSET Diploma，我认为这并不意味着它没有价值。相反，它支撑着葡萄酒教育，让一些不学无术的人无法在葡萄酒行业中立足。我相信WSET也会采取措施来保持其声望。”

1.2.5 采用Western blot检测亚细胞克隆中MMP-2、MMP-9及Id1的表达

配制10%的分离胶和5%的积层胶，分离胶中加入10%的明胶溶液。凝胶制好后，25 mA恒流至溴酚蓝前沿于分离胶最前端时，停止电泳。凝胶加入明胶缓冲液中温育12～16 h。凝胶染色4 h，脱色1～2 h，至对照出现明显清晰的负染酶带。

1.2.6 RT-PCR鉴定亚细胞克隆MMP-2、MMP-9及Id1的表达

RT-PCR相关引物序列及产物见表1。RTPCR反应条件：94 ℃变性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸45 s，共30个循环。扩增产物用10 g/L琼脂糖凝胶进行电泳。

1.2.7 ELISA检测不同转染细胞上清液中的MMP-2、MMP-9蛋白含量

实验过程中，我们同时转染了多个Id1小干扰RNA，并依顺序编号。与空载体转染SGC7901细胞相比，Id1-siRNA可显著下调Id1在SGC7901细胞中的表达，反之Id1正义细胞中Id1的表达上调(图2)。

1.2.8 明胶酶谱法检测转染细胞中MMP-2、MMP-9的活性

连锁药店承接基层医疗卫生机构药房职能可行性的调查分析 ……………………………………………… 周梅梅等（19）：2699

经G418筛选12周后，获得稳定转染的细胞亚系。收集约106对数生长期细胞，用含蛋白酶抑制剂的三去污裂解，细胞总蛋白质用Bradford方法蛋白定量；50 μg蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用电转移法转膜，丽春红染色，剪下相应蛋白电泳条带，100 ml/L脱脂奶粉室温封闭2 h，加入一抗(Id1为1∶ 100，MMP-2为1∶400，MMP-9为1∶800)。4 ℃过夜，TBST缓冲液洗膜4次，加入HRP标记的羊抗鼠(羊抗兔)二抗，37 ℃温育2 h，洗膜4次，ECL显影。

1.2.9 裸鼠体内成瘤实验

正义链：5’-GATCCACGTGCTGCTCTACG ACATTTCAAGAGAATGTCGTAGAGCAGCACGT TTTTTTGGAAA-3’；反 义 链：5’-AGCTTTTCC AAAAAAACGTGCTGCTCTACGACATTCTCTTG AAATGTCGTAGAGCAGCACGTG-3’。

1.3 统计学处理

1.2.4 Id1正义及siRNA的转染

2 结 果

2.1 Id1和MMP-2，MMP-9在胃癌组织中的共表达

免疫组织化学结果提示(图1)，胃癌组织中Id1和MMP-2、MMP-9阳性染色主要位于细胞质，胃癌组织中Id1和MMP-2、MMP-9共表达，MMP-2与Id1的共表达率为73.7%，MMP-9与Id1的共表达率为69.3%。

明曹学佺《蜀中广记》卷六十三《方物记》第五：“黄山谷戎州与人帖：昨日市中已见腊梅，开者数枝矣。有词曰：……右调《满江红》。自注：与夔州崔三伯礼侍御同作。”所引词作即此。按此当为陆游词，《全宋词》辑入陆游名下，题作《夔州催王伯礼侍御寻梅之集》。陆游在乾道六年十月至乾道八年正月期间，任夔州通判，与夔州知州王伯礼相友善。除此词外，陆游另有《感皇恩·伯礼立春日生日》、《蓦山溪·送伯礼》二词，并为王伯礼作《王侍御生祠记》及《云安集序》。

2.2 Id1正义和siRNA转染的SGC7901细胞亚系的鉴定及Id1的表达

将细胞接种于6孔板，约3×105个/孔，细胞达到90%融合后，换无血清培养液。24 h后，分别取细胞上清液500 μL。参照人血清MMP-2、MMP-9酶联免疫试剂盒，以1∶2的比例测定样品D值(490 nm)，并建立标准曲线，分析样品的蛋白含量。

表 1 RT-PCR相关引物及产物Tab.1 The primers and products by RT-PCR

2.3 SGC7901/Id1-siRNA细胞中MMP-2、MMP-9的蛋白及mRNA水平的变化

石蜡切片常规脱蜡，3%H2O2溶液温育。蒸馏水冲洗后，PBS振洗3次，3 min/次。滴加10%正常羊血清，37 ℃温育20 min，滴加羊抗人Id1或MMP-2、MMP-9多克隆抗体一抗(Id1为 1∶ 100，MMP-2为 1∶ 100，MMP-9为1∶200)，4 ℃过夜。复温后滴加1∶100兔抗羊二抗37 ℃温育30 min；滴加SABC液体，37 ℃温育20 min。加入新鲜配置DAB试剂，苏木精衬染；脱水、透明。中性树脂封片，在光镜下行结果判断。

会计工作作为企业日常工作中的重要组成部分，在各个企业单位正常顺利的运行中发挥着重要作用，而随着我国信息技术的不断发展完善，会计电算化打破了会计理念的传统性，使其不再故步自封，使会计信息处理的速度和准确性得到了充分的保障，对会计工作方法有些极其重大的影响，我们也应当将会计电算化更加彻底的作用到会计工作中来。

综上所述，超声引导下的胸神经阻滞可为乳腺癌改良根治术患者提供良好的术后镇痛，减少不良反应的发生，值得临床推广应用。

2.4 SGC7901/Id1-siRNA细胞的培养上清液中MMP-2、MMP-9的表达

ELISA检测结果提示，与空载体转染SGC7901P细胞相比，Id1-siRNA细胞可显著抑制MMP-2、MMP-9的释放，并且Id1的抑制效率越高，细胞培养上清液中MMP-2、MMP-9的含量越低(图5，P＜0.05)。

（3）造成谐波污染。在运行的过程中，逆变器开关的反复开断是一种难以规避的问题，如此一来，便会制造一个和开关频率大小相等或者接近的谐波分量，进而造成谐波污染问题。

2.5 Id1对MMP-2、MMP-9活性的影响

明胶酶谱法结果提示(图6)，在SGC7901/Id1-siRNA细胞中MMP-2、MMP-9的活性下调，同时Id1的抑制越强，MMP-2、MMP-9的表达越弱。

2.6 SGC7901/Id1-siRNA细胞在裸鼠体内成瘤组织中MMP-2及MMP-9的表达

免疫组织化学染色结果表明，SGC7901/Id1-siRNA细胞在裸鼠体内成瘤组织中MMP-2及MMP-9的表达较SGC7901P细胞显著减弱，同时对Id1的抑制越强，MMP-2、MMP-9的表达越低(图7)。组织Western blot结果提示，成瘤组织中MMP-2、MMP-9的蛋白水平下调，并且在Id1抑制越高的成瘤组织MMP-2、MMP-9的表达越低(图8)。

3 讨 论

Id是bHLH转录因子亚家族成员，包括Id1、Id2、Id3和Id4。与其他所有的bHLH不同的是Id蛋白缺乏碱性DNA结合域，因此与DNA结合只能形成无功能的异源二聚体而抑制bHLH因子的转录活性。4种Id蛋白在HLH区域有很强的同源性，因此在功能上有许多重复性。多项研究证实Id基因在人类多种原发性肿瘤中过表达，能够诱导恶性肿瘤的发生，但尚未发现Id在基因水平的异常扩增和突变，故现将其称为准原癌基因［5］。近几年来对Id基因在肿瘤方面的研究越来越深入，大量实验表明，Id蛋白在恶性肿瘤的发生、转移及浸润等过程中发挥重要作用，尤其以其与肿瘤血管生成的关系最密切，但其调控机制尚不完全清楚［6］。已有结果提示，肿瘤细胞高表达Id1可以募集骨髓内皮前体细胞向肿瘤局部迁移，可诱导HUVECs的增殖、分化和血管生成。敲除Id1可完全抑制由血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)诱导的HUVECs的增殖、活化和血管生成，而在HUVECs中加入VEGF后，可诱导Id1的表达［7］。这些发现提示Id1在VEGF诱导HUVECs增殖、血管生成中起重要作用。也有文献报道在前列腺癌中Id1通过激活VEGF的转录而促进肿瘤的血管生成［8］。作为转录因子，Id1可以发挥双向调节作用，能够通过抑制血管生成抑制剂TSP-1的转录促进肿瘤的血管生成［9］。另外Id1能与其他促血管生成因子如αγβ3整合素、β5-整合素、bFGF、MMP-2以及Ephrin和TGF家族成员相互作用，从而发挥促肿瘤血管生成作用［10-11］。本研究的前期工作发现，COX-2通过对Id1的调控而参与了胃癌血管生成，并且Id1可以通过直接促进VEGF的表达而放大这种促血管生成效应［12］。综上所述，Id1是一类新的促血管生成因子，可能通过调控下游分子的转录而促进肿瘤血管生成。

恶性肿瘤的生物学特性之一是无限制生长，并在此基础上发生浸润和转移，而基底膜是机体阻断肿瘤浸润和转移的天然组织屏障。肿瘤细胞自身或刺激宿主细胞分泌多种蛋白水解酶对基底膜和ECM的降解是肿瘤浸润和转移过程中极其关键的环节，其中MMPs起着决定性作用。而目前较多的研究已证实，MMPs在血管生成中的作用远较其降解ECM作用复杂且重要的多，所以MMPs也是一类促血管生成分子。多种MMPs通过降解ECM释放促血管原性因子，调控内皮细胞的迁移和管状形成［13］。MMP-2和 MMP-9是MMPs家族成员，在多种肿瘤中高表达，在促肿瘤血管生成中发挥至关重要的作用。研究提示MMP-2、MMP-9诱导肿瘤血管生成可能是其促癌机制之一。MMP-2-/-MMP-9-/-小鼠移植瘤的血管生成较野生型明显减少［4］。在卵巢癌、胰腺癌中MMP-2、MMP-9在血管内的表达增高［14］，在乳腺癌中MMP-9的高表达可诱导肿瘤的血管生成和生长加速［15］。

本实验室的前期工作表明，Id1在胃癌组织中表达增高，并与胃癌细胞的恶性生物学行为相关［16］，体内实验发现Id1参与了肿瘤的血管生成。另有报道提出，在Id1基因敲除的鼠胚胎纤维母细胞的培养上清液中MMP-2的活性下降［4］。那么作为两类重 要的促血管生成分子，Id1和MMP-2、MMP-9在胃癌血管生成中的关系如何，又是怎样发挥作用的呢？

选取我院2016年1月—2018年1月收治的80例白血病PICC导管瘤患者作为研究对象。根据护理的不同可以分为实试验组和常规组，每组患者40例。纳入标准为：符合白血病临床诊断，需静脉化疗，生命体征在正常范围；排除标准：不愿参加本次实验患者，合并肾肝肺等严重疾病患者，精神、心理疾病患者。实验组中，男性患者26例，女性患者14例，年龄15～65岁，平均年龄（43.92±3.25）岁；常规组中，男性患者25例，女性患者15例，年龄为16～66岁，平均年龄（44.12±4.86）岁。两组患者的一般资料对比，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

本研究表明，Id1和MMP-2、MMP-9在大多数胃癌组织中共表达，提示Id1和MMP-2、MMP-9均与胃癌的发生有关；利用小干扰RNA技术建立Id1低表达的SGC7901细胞系，发现在Id1低表达的胃癌细胞中MMP-2和MMP-9的蛋白以及mRNA水平均下降，同时MMP-2、MMP-9的活性也下调，并且随着Id1抑制效率的不同，MMP-2、MMP-9的表达及活性也不同。本研究检测了SGC7901/Id1-siRNA细胞的培养上清液中MMP-2、MMP-9的蛋白含量，结果表明Id1-siRNA细胞可显著抑制MMP-2、MMP-9的释放，并且Id1的抑制效率越高，MMP-2、MMP-9的蛋白含量越低。以上体内实验结果提示：Id1对MMP-2、MMP-9有正性调控作用，MMP-2和MMP-9是Id1的下游分子。体外裸鼠成瘤实验进一步证实，Id1有促癌作用，Id1低表达的成瘤组织MMP-2、MMP-9的表达下调，同时对Id1的抑制越强，MMP-2、MMP-9的表达越低。针对Id1在胃癌生成作用中对MMPs的正向调节作用，抑制Id1同时也能够抑制MMPs的表达，使得Id1成为新的有效的抗肿瘤血管生成的靶标。

［1］JANG K S, HAN H X, PAIK S S, et al.Id1 overexpression in invasive ductal carcinoma cells is significantly assiociated with intratumoral microvessel density in ER-negative/nodepositive breast cancer ［J］.Cancer Lett, 2006, 244(2): 203-210.

［2］JEN Y, WEINTRAUB H, BENEZRA R.Overexpression of Id protein inhibits the muscle differentiation program: In vivo association of Id with e2a proteins ［J］.Genes Dev, 1992, 6:1466-1479.

［3］MIRA E, LACALLE R A, BUESA J M, et al.Secreted MMP9 promotes angiogenesis more efficiently than constitutive active MMP9 bound to the tumor cell surface ［J］.Cell Sci, 2004,117: 1847-1856.

［4］CHANTRAIN C F, SHIMADA H, JODELE S, et al.Stromal matrix metalloproteinase-9 regulates the vascular architecture in neuroblastoma by promoting pericyte recruitment ［J］.Cancer Res, 2004, 64: 1675-1686.

［5］SUN X H, COPELAND N G, JENKINS N A, et al.Id proteins id1 and id2 selectively inhibit DNA binding by one class of helix-loop-helix proteins ［J］.Mol Cell Biol, 1991, 11:5603-5611.

［6］LYDEN D, YOUNG A Z, ZAGZAG D, et al.Id1 and Id3 are required for neurogenesis, angiogenesis and vascularization of tumour xenografts ［J］.Nature, 1999, 401: 670-677.

［7］SAKURAI D, TSUCHIYA N, YAMAGUCHI A, et al.Crucial role of inhibitor of DNA binding/differentiation in the vascular endothelial growth factor-induced activation and angiogenic processes of human endothelial cells ［J］.J Immunol, 2004,173: 5801-5809.

［8］LING M T, LAU T C, ZHOU C, et al.Overexpression of Id1 in prostate cancer cells promotes angiogenesis through the activation of vascular endothelial growth factor(VEGF) ［J］.Carcinogenesis, 2005, 26: 1668-1676.

［9］VOLPERT O V, PILI R, SIKDER H A, et al.Id1 regulates angiogenesis through transcriptional repression of thrombospondin-1 ［J］.Cancer cell, 2002, 10: 473-483.

［10］REYNOLDS L E, WYDER L, LIVELY J C, et al.Enhanced pathological angiogenesis in mice lacking beta3 integrin or beta3 and beta5 integrins ［J］.Nat Med, 2002, 8: 27-34.

［11］PFEIFER A, KESSLER T, SILLETTI S, et al.Suppression of angiogenesis by lentiviral delivery of PEX, a noncatalytic fragment of matrix metalloproteinase 2 ［J］.Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97: 12227-12232.

［12］雷婷, 韩霜, 郭雪艳, 等.Id1在COX-2介导的胃癌血管生成中的作用及机制研究［J］.中华医学杂志, 2007, 87(22):1570-1573.

［13］NGUYEN M, ARKELL J, JACKSON C J.Human endothelial gelatinases and angiogenesis ［J］.Int J Biochem Cell Biol,2001, 33: 960-970.

［14］BERGERS G, BREKKEN R, MCMAHON G, et al.Matrix metalloproteinase-9 triggers the angiogenic switch during carcinogenesis ［J］.Nature Cell Bio, 2000, 2: 737-744.

［15］MIRA E, LACALLE R A, BUESA J M, et al.Secreted MMP9 promotes angiogenesis more efficiently than constitutive active MMP9 bound to the tumor cell surface ［J］.J Cell Sci, 2004,117: 1847-1856.

［16］HAN S, GOU C, HONG L, et al.Expression and significances of Id1 helix-loop-helix protein overexpression in gastric cancer ［J］.Cancer Lett, 2004, 216: 63-71.