厉眼蕈蚊高活性Bt菌株的筛选*

张 丽，吴梅香**，罗 佳，张灵玲，黄雪峰，尤梅苹，范青海

（1.福建农林大学植物保护学院，福建 福州 350002；2.福建农林大学生命科学学院，福建 福州 350002）

厉眼蕈蚊 （Lycoriella sp.）隶属于双翅目 （Diptera）、长角亚目 （Nematocera）、 眼蕈蚊总科 （Sciaroidea）、 眼蕈蚊科 （Sciaridea）， 其中平菇厉眼蕈蚊 （Lycoriella pleuroti Yang et Zhang）是我国危害食用菌的优势种[1]。厉眼蕈蚊主要以幼虫取食菌丝、菇蕾以及钻蛀菌柄进行为害，并能分解菌料中的有效成分，导致菇体萎缩；成虫虽不取食，但能够传播食用菌病害和害螨[2]。目前，食用菌生产上防治厉眼蕈蚊最普遍的方法是化学防治。然而，化学药剂存在药剂残留和害虫抗药性等多种副作用，尤其是药剂残留问题在生长周期较短的食用菌上尤为突出。物理防治目前还无法有效控制害虫发生。因此，生物防治愈来愈成为食用菌害虫防治方法研究的焦点。苏云金芽孢杆菌 （Bacillus thuringiensis，简称Bt）是研究最多、应用最广的一类杀虫微生物。由于其分布极广，且不同菌株间杀虫谱及杀虫活性存在差异，因此，通过对各种Bt菌株进行活性测试，筛选对食用菌害虫具有高活性和特异杀虫活性的菌株，对将来实施食用菌害虫的无害化防治具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 供试虫源

供试厉眼蕈蚊采自福州金山福建农林大学菌物研究中心长根菇废弃菌袋。饲养方法参考王梓清的简易大量饲养方法[3]，以山药为替代饲料进行饲养。

1.2 Bt菌株和培养基

1.2.1 Bt菌株

供试的46个菌株，由福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室生物农药研究室提供。

1.2.2 培养基

LB固体培养基：蛋白胨10 g、酵母膏5 g、氯化钠10 g、 琼脂粉 17 g， 蒸馏水 1 000 mL， pH 7.0～7.2， 分装后灭菌。

LB液体培养基：蛋白胨10 g、酵母膏5 g、氯化钠10 g， 蒸馏水 1 000 mL， pH 7.0～7.2， 分装后灭菌。

PM发酵培养基：蛋白胨10 g、酵母膏2 g、KH2PO40.1 g、 FeSO4·7H2O 0.02 g、 ZnSO4·7H2O 0.02 g、 MgSO4·7H2O 0.30 g、 MnSO4·H2O 0.0328 g， 水 1 000 mL， pH 7.0～7.2，分装后灭菌。

1.3 菌株发酵液制备

在无菌条件下，将保藏的甘油菌按100∶1的接种量接于 5 mL的 LB试管液体培养基中， (30±1)℃、 220 r·min－1摇床培养，24 h后按同样的接种量转接于PM发酵培养基中， (30±1)℃、 220 r·min－1摇床培养， 72 h 后进行生测。

1.4 供试Bt菌株胃毒活性测定

参考慕卫韭菜迟眼蕈蚊的生测方法及防治药剂研究[4]，采用浸渍山药饲喂法测定供试Bt菌株对厉眼蕈蚊7日～8日龄幼虫的毒力。将山药切成大小一致的薄片 （厚约2 mm～3 mm），在Bt发酵液中浸30 min后放入直径6 cm的培养皿中，培养皿底部放入1层滤纸用以保湿，然后挑入厉眼蕈蚊幼虫，20头/皿。以山药浸入未接菌的PM发酵培养基为对照，每处理重复3次，于25℃、相对湿度85%的条件下饲养，48 h后在显微镜下观察死亡虫数，计算死亡率和校正死亡率。校正死亡率达50%以上作为初筛有效菌株[5]，之后对初筛有效菌株进行复筛。

1.5 菌株复筛

1.5.1 发酵液原液浓度

用平皿计数法计算初筛有效菌株发酵液原液的活菌数。具体做法：在无菌条件下，将菌株发酵液原液经一系列稀释，然后用移液器移取10－6的稀释菌液0.2 mL放入无菌平皿，再倒入适量的已熔化并冷却的LB培养基，与菌液混匀，重复4次，冷却后放入 (30±1)℃恒温培养箱中，24 h后计数，计算出每毫升菌株发酵液原液的活菌数，计算公式如下：

式中：N1为平皿菌落平均数；n为稀释倍数。

1.5.2 复筛

在预试的基础上，分别将初筛有效菌株发酵液原液依次稀释为5个浓度，然后对不同浓度的菌液进行活性测定，方法同初筛。48 h后开始检查结果，连续观察4 d，根据96 h后的观察结果，采用SPSS17.0软件进行数据处理，求出毒力回归方程及LC50。

2 结果与分析

2.1 初筛结果

将46株Bt菌株分别感染厉眼蕈蚊7日～8日龄幼虫，48 h后观察，发现BRC－LLP29和IPS82两个菌株为初筛有效菌株，校正死亡率分别达到了87.93%和70.21%，见表1。

感染Bt的厉眼蕈蚊幼虫食欲减退，对毛笔触动反应迟钝，有腹泻现象，死亡后虫体变暗，轻触易破。实验中还发现，刚挑入浸有Bt发酵液的山药片上的厉眼蕈蚊幼虫会迅速爬离山药片，24 h观察时，大部分幼虫才会钻入山药片中或隐藏于山药片与滤纸片之间，而对照中挑入的厉眼蕈蚊幼虫不爬离山药片。推测可能是因为厉眼蕈蚊幼虫对部分Bt菌株发酵液本身的气味有一段适应过程。

表1 厉眼蕈蚊高活性Bt菌株的初步筛选

2.2 复筛结果

对初筛有效菌株BRC－LLP29和IPS82进行室内毒力测定，结果见表2。

表2 厉眼蕈蚊有效Bt菌株的室内毒力测定

从表2得出处理96 h后，BRC－LLP29菌株对厉眼蕈蚊的LC50为 1.182×108cfu·mL－1， IPS82 为 1.977×108cfu·mL－1，由此可见，BRC－LLP29菌株对厉眼蕈蚊的活性高于IPS82菌株。

3 讨论

菌株筛选是发现厉眼蕈蚊高活力Bt菌株的重要手段。通过菌株筛选，发现了2株对厉眼蕈蚊幼虫有高活性的菌株 （IPS82和BRC－LLP29菌株）， 其中BRC－LLP29菌株的活性高于IPS82菌株。IPS82菌株为苏云金芽孢杆菌以色列亚种，该亚种是第1个被发现对双翅目蚊虫有强杀虫活性的Bt菌株[6]。在食用菌害虫防治上，国外在上世纪九十年代已有应用Bt菌株防治蘑菇金翅厉眼蕈蚊的研究。1990年，White和Jarret以蘑菇金翅厉眼蕈蚊为试虫，对IPS82和GC315两个菌株进行了毒力测定，结果二者的LC50分别为 130 mg·kg－1和 31.4 mg·kg－1， 且田间试验结果表明GC315的杀虫效果与化学杀虫剂除虫脲相当[7]。White等通过菌株筛选，又发现了对金翅厉眼蕈蚊有活性的GC327菌株，该菌株的杀虫效果与化学杀虫剂一样，而且没有副作用，因此，对该菌株进行了半商业化试验[8]。由此可以看出，这两个菌株的杀蚊效果均已超过了以色列亚种。我国于1979年从国外引进以色列亚种[9]，至今在应用方面也仅限于对水生蚊虫的防治。

在食用菌害虫的生物防治研究中，有应用Bt防治食用菌害虫的尝试，蒋时察等在Bt菌株对平菇瘿蚊的防效试验中发现，应用生物农药Bt7216固体菌粉与少量菊酯类农药复配可以取得较好的防治效果[10]，但该试验并未说明单独应用Bt菌株后的防效。本实验在室内条件下对Bt菌株发酵液进行毒力测定得出的结果，认为BRC-LLP29菌株在浓度较高的情况下对厉眼蕈蚊有较好的控制效果，且其杀虫效果亦超过了以色列亚种的IPS82菌株。但其作用缓慢，杀虫速度远远比不上吡虫啉、阿维菌素等化学杀虫剂。因此，今后应该在菌株基因改造、工程菌构建以及与其他杀虫剂混配等多个方面进行深入研究，以提高其杀虫效果，同时，考虑到食用菌是真菌，故有必要在Bt菌株对食用菌生长的影响方面做进一步研究。

[1]张学敏，杨集昆，谭琦.食用菌病虫害防治[M].北京：金盾出版社，1994.

[2]沈登荣，张宏瑞，张陶.我国食用菌眼蕈蚊的研究现状[J].中国食用菌，2008，27(1)：48-50.

[3]王梓清，罗佳，王伯明，等.厉眼蕈蚊简易大量饲养方法[J].中国食用菌，2008，27(5)：52-53.

[4]慕卫，丁中，何茂华，等.韭菜迟眼蕈蚊的生测方法及防治药剂研究[J].华北农学报， 2002， 17(增刊)： 12-16.

[5]张灵玲，林晶，骆兰，等.叶面分离Bt及对茶树主要害虫高毒力菌株的筛选[J].茶叶科学，2005，25(1)：56-60.

[6]赵新民，夏立秋，王发祥，等.杀蚊苏云金芽孢杆菌及其晶体蛋白研究进展[J].昆虫知识，2007，44(3)：337-342.

[7]White PF,Jarret P.Laboratory and field test with Bacillus thuringensis for the control of the mushroom sciarid Lycoriella auripila[C].Brighton Crop Protection Conference:Pests and Diseases,1990.

[8]White PF,Butt J,Pethybndge NJ,et al.The story of a strain:Development of GC327,a dipteran-active strain of Bacillus thuringiensis effective against the mushroom sciarid,Lycoriella auripila science and cultivation of edible fungi[J].The International Society for Mushroom Science,1995,14(2):499-506.

[9]喻子牛.苏云金杆菌以色列变种在我国的研究[J].华中农学院学报，1982(6)：93-97.

[10]蒋时察，庄燕平.BT防治平菇瘿蚊试验[J].长江蔬菜，1994(1)：20.