鱼类病毒病的研究进展及其展望

冯东岳 温周瑞

1.全国水产技术推广总站,北京 100125;2.湖北省水产科学研究所,武汉 430071

近年来,随着我国水产养殖业的迅速发展,其在农业产值中所占的比重也逐年上升,已成为中国农业的四大支柱产业（粮食、肉类、水产和禽蛋）之一。据国家统计局统计,2009年我国渔业经济总产值11 445.13亿元,渔业产值占农林牧渔业总产值的9.32%,比2008年增长0.34%。2009年我国水产品总产量为5 116.40万t,其中养殖产量为3 621.68万t,占总产量的70.79%,可见养殖业已经成为渔业经济的重要支柱。但随着养殖规模的不断扩大,养殖密度的不断增大,发生病害的几率也逐渐加大,每年造成的经济损失达100～150亿元,病害已经成为制约水产养殖业健康发展的瓶颈因素之一。

水生动物的疾病包括病毒病、细菌病、真菌病和寄生虫病等。其中病毒病的病原体微小、在宿主细胞内复制、潜伏期长,导致病毒病症状复杂多变、传染性强、死亡率高、难以防控,严重危害水生动物的养殖,易造成巨大的经济损失[1-2]。国际动物卫生组织OIE要求各成员国每年必须申报的水生动物疫病绝大部分是病毒病,如2010年要求必须报告的水生动物疫病有25种,其中病毒病16种、寄生虫病6种、真菌病3种。因此,水生动物病毒病引起的危害越来越严重,已受到国内外的广泛关注。

1 主要鱼类病毒

自从Wolf分离到第一株鱼类病毒（传染性胰腺坏死病毒）[3]以来,迄今见报道的鱼类病毒已超过70种,在绝大多数动物病毒科中都有分布[4]。其中有30多种鱼类病毒分离成功,基本上属于疱疹病毒科、呼肠孤病毒科、虹彩病毒科、副粘病毒科、双RNA病毒等,表1列举了一些对水产养殖业危害较严重的病毒。

表1 主要鱼类病毒及其宿主

2 部分鱼类病毒病的临床症状

2.1 斑点叉尾鮰病毒病

病鱼双眼突出,鱼体发黑、鳃发白,继而表皮和鳍条基部充血,腹部膨大,还表现为行为异常,嗜睡,旋转或垂直悬挂于水中,最后下沉死亡。解剖后可见肌肉充血,体内有黄色渗出物,肝、脾、肾充血或肿大,胃内无食物,后肾损伤较严重并出现水肿,最典型的组织病理变化是肾管和肾间组织的广泛性坏死。

2.2 草鱼出血病

病鱼鳃充血、体发黑、眼突出,体表、口腔、鳃盖和鳍条基部可见出血,撕开表皮可见肌肉点状或块状出血。解剖后可见肠系膜、肝、脾、肾等内脏出血,有的病鱼的肝因失血而出现发黄症状。

2.3 传染性造血器官坏死病

该病暴发时,稚鱼和幼鱼的死亡率突然升高。病鱼表现为昏睡、顶水,行为异常,狂奔乱窜、打转。病鱼的眼球突出且变黑,鳃苍白,腹部膨胀,鳍基部和头部之后的侧线处皮下出血,较为典型的特征是肛门拖一条不透明或棕褐色的假管型黏液样粪便。

2.4 传染性胰腺坏死病

病鱼体色发黑,眼球突出,腹部膨大,腹部及鳍基部充血,鳃呈淡红色,肛门处常拖有一条线状黏液便。病鱼还表现为游动失调,常作垂直回转运动,一会儿沉入水底,一会儿又重复回转游动,直至死亡。解剖后可见消化道内没有食物,黏膜变性、坏死,肝、脾、肾水肿并异常苍白,胰腺组织严重坏死。对胰脏组织进行超薄切片,可观察到在细胞的胞浆中有包涵体存在。

2.5 真鲷虹彩病毒病

病鱼未见异常则逐渐死亡。解剖后可见脾脏和肾脏肿大;脾脏和心脏组织内出现真鲷虹彩病毒病常见的肥大细胞,但数量不多。病理组织学变化表现为脾髓、肾脏造血组织、肝脏有坏死病灶形成,各脏器血管和心脏有细胞浸润发生。

2.6 锦鲤疱疹病毒病

病鱼停止游泳,眼凹陷,皮肤上出现苍白色的斑块与水疱,鳃出血、黏液增多、组织坏死且有大小不等的白色斑块,鳞片有血丝,体表黏液增多且变稠。病鱼一般在出现症状后24～48 h内死亡。

2.7 鲤春病毒血症病

该病通常于春季（水温20℃以下）暴发,引起幼鱼和成鱼死亡。发病时,病鱼行为失常,无目的地漂游,呼吸困难,体色发黑,眼球突出,腹部膨大,肛门红肿,体表（皮肤、鳍条、口腔）和鳃充血。解剖时,全身出血、水肿、有大量的血性腹水,消化道出血,心、肾、鳔、肌肉出血并出现炎症,最常见的是鳔内壁出血。

2.8 病毒性出血性败血症

急性感染者表现为嗜睡,外观色暗,实质器官和肌肉出血以及游泳障碍和死亡。慢性感染时病鱼表现冷漠或持续性死亡。解剖病鱼可见肌肉、肠道出血,肾脏坏死,部分病鱼腹腔中有腹水。

3 鱼类病毒病的检测和鉴定

目前,用于鱼类病毒病检测和鉴定的技术主要包括电子显微镜技术、细胞培养技术、免疫学技术、分子生物学技术和基因芯片技术等。

3.1 电子显微镜技术

目前,电镜用于水生动物病毒的研究,其视野并不局限于观察细胞病变、病毒的形态大小和分类,已扩展到了解病毒的感染、复制机理和病毒的形态发生等[5]。病毒囊膜的有无是水生动物病毒的基本结构及分类特征之一,对此,电镜观察能提供直接证据,如姜明等[6]用电子显微镜对一种真鲷球形病毒的形态及细胞病理学进行了观察。徐洪涛等[7]通过电镜观察到了患虹彩病毒病的大菱鲆鳍、鳃、肾、脾、肝、胰、心及脑组织中的虹彩病毒病原,从而进行初步确诊。

3.2 细胞培养技术

细胞培养技术是病毒学研究的基础,也是病毒病诊断的经典方法之一。目前已建立的鱼类细胞系很多,已有30余种鱼类病毒在细胞培养中分离成功。国外已有利用培养细胞研究淋巴囊肿病毒（属于虹彩病毒科）的报道。国内左文功等[8]在1981年就开始进行草鱼肾脏组织单层细胞的培养,并利用此细胞分离到了草鱼出血病的病毒颗粒。张奇亚等[9]通过建立呈上皮细胞形态的草鱼椎骨间质细胞系GCVB,表明GCVB细胞对蛙虹彩病毒中国分离株RGV9506及蛙虹彩病毒美国分离株FV3敏感,可引起不同程度的病变。吕宏旭等[10]利用牙鲆鳃细胞系进行了养殖牙鲆淋巴囊肿病毒的分离及培养。曾令兵等[11]采用细胞培养分离病毒技术从患出血病的斑点叉尾鮰体内分离到一株新病毒,经人工感染试验、电镜观察、理化特性试验以及病毒基因组分析,确认为斑点叉尾鮰呼肠孤病毒。

3.3 免疫学技术

免疫学技术包括中和实验、荧光抗体技术和酶联免疫吸附实验（ELISA）。中和实验是鱼类病毒鉴定中使用最为普遍的免疫学技术,已成为鱼类病毒鉴定的经典方法,目前已广泛应用于IPNV、PFRV、SVCV、VHSV、IHNV及CCV等的常规诊断。相比较而言,荧光抗体技术和ELISA可在几小时之内得到结果,从而可以满足快速诊断的需要。荧光抗体技术目前已在 IPNV、VHSV、CCV、PFRV、SVCV及IHNV等的检测中普遍使用,特别是若把细胞培养技术和荧光抗体技术结合起来,则可显著提高荧光抗体技术的敏感性。ELISA目前亦用于IPNV、VHSV、CCV、PFRV 及 SVCV 的检测。ELISA灵敏度高,特异性好,能同时进行大样本检测。江育林等[12]用ELISA达到了快速检测虹鳟的传染性胰脏坏死病病毒的目的。

3.4 分子生物学技术

分子生物学技术主要应用聚合酶链反应（PCR）,是一项DNA在体外合成的放大技术。根据PCR原理,人们研究出多种不同的PCR技术,包括常规PCR、逆转录PCR、套式PCR、荧光实时定量PCR技术等,并且已经成功运用于检测细菌和病毒。邓敏等[13]根据真鲷虹彩病毒（RSIV）核苷酸还原酶小亚单位（RNRS）基因的高度保守区探索性地设计并合成一对引物,报道了鳜鱼病毒的PCR检测方法,可检测到0.1 pg病毒DNA。苗素英等[14]用PCR方法检测到虎纹蛙病毒中有虹彩病毒的存在。吕玲等[15]对一种蛙病毒进行酶切、PCR扩增后,通过比较酶切图谱、PCR扩增产物,证明该病毒为蛙虹彩病毒属的一种。范万红等[16]利用PCR的检测方法,扩增蛙病毒属衣壳蛋白（MCP）410 bp的DNA片段,用该方法从患“红脖子”病的甲鱼中分离的病毒毒株（9701株）中扩增出特异性的片段,经比较分析初步判定9701株属于蛙病毒属。

3.5 基因芯片技术

基因芯片技术是一种高通量、快速、平行核酸序列测定及定量分析技术。它是在一块大小不等的载玻片、硅片、尼龙膜等载体材料上,以大规模阵列的形式排布了不同的核酸探针,形成可以与目的靶分子相互作用,并进行反应的固相表面。通过与标记核酸分子杂交,用激光共聚焦荧光扫描仪或其他检测手段检测杂交信号强弱而判断样品中靶分子的组成及数量,该技术可以将大量的核酸分子同时固定在载体上,形成高通量检测分析的能力,在大量样品和多种病毒的检测分析中有很大优势。许拉等[17]采用基因芯片技术原理,达到了在一个载体上同时检测2个样品和12种水生动物病毒的目的。这一技术在大批量病毒快速检测中应用得非常广泛。

4 鱼类病毒病的防治

4.1 免疫预防

由于病毒病目前尚无较好的治疗办法,因而免疫接种就成为预防病毒病暴发、控制病毒病蔓延的主要手段。目前,国外已有数十种鱼类病毒病疫苗商品化,而国内鱼类病毒病疫苗研究仍处于试验阶段,尚无商品化疫苗。鱼类病毒病疫苗主要有灭活苗和弱毒苗2种。灭活疫苗研究较多,包括IPNV灭活苗、VHSV灭活苗、SVCV灭活苗及GCRV灭活苗等。弱毒苗中天然弱毒株很少,目前仅有一株自河鲈中分离到的IPNV,它对虹鳟安全无害,而且具有良好的免疫原性。弱毒苗能通过自然感染途径进入鱼体,除可诱导体液抗体产生外,还能产生局部免疫,因而免疫效果较好。但是,由于弱毒株具有回复突变的可能,因而在安全性上远不如灭活苗。

4.2 药物防治

有关鱼类病毒病的化学药物防治的资料不多。目前广泛采用的是一种有机碘制剂（PVP）,已有资料表明,它能降低患传染性造血器官坏死症的红点鲑幼鱼的死亡率。据报道,PVP能有效破坏IHNV、IPNV和VHSV,因而常用于鱼卵的消毒,但若病毒存在于卵膜内,用PVP处理也无效。此外,亦有资料表明,氯化铵可以抑制IPNV在CHSE-214细胞中增殖,苯丙咪唑钠可抑制细胞的增殖,但均未进行鱼体试验。此外,天然植物药物具有广谱高效的抗病毒效果,开发天然植物抗病毒药物,是未来水产养殖动物病毒病防控技术研究的重要方向,且对于水环境安全、水产品质量安全以及人类健康有重要意义。

4.3 严格执行检疫制度

限制把疫区的鱼运到非疫区是控制病毒传播的重要方法之一。因为疫区的鱼,不管是患病鱼,还是疫病流行后的存活鱼,体内的精液及卵液,多数都带有病毒,一旦被引入非疫区的易感鱼群,就会造成易感鱼群的大量死亡。因此,在鱼被引入新区之前,应进行严格的检疫。有鉴于此,不少国家已制定并执行了鱼病法,制定了一些相应的有关鱼类病原体检测和鉴定的程序。中国颁布的动物检疫条例中也包括了鱼病（主要是病毒病）的检疫,这标志着鱼类病毒的研究进入了一个全新的阶段。

5 鱼类病毒病研究展望

今后鱼类病毒病研究方向主要是快速诊断试剂盒的研制和疫苗的研发。应用现代分子生物学和免疫学技术可以达到早期和快速诊断的目的,随着对鱼类病毒分子生物学研究的不断深入,尤其是DNA分离技术的提高、PCR技术的日趋完善、各种探针标记方法的发展,使得核酸检测技术检测各种病毒更为方便、安全、快捷,为快速诊断试剂盒的研制提供了技术基础。同时,由于现代分子生物学技术的发展,也为建立有效控制水生动物病毒病提供了新的方法和途经。例如,对部分鱼类病毒的基因组结构已阐明,其编码蛋白的性质和功能也被初步揭示,这为定向抗病毒育种技术研究、抗病毒药物筛选与应用等奠定了坚实的基础。

从长远看,研发免疫保护效果好的灭活疫苗以及研究新技术疫苗,如DNA疫苗、基因工程亚单位疫苗、载体表达口服疫苗、转基因植物疫苗等,是未来鱼类疫苗研制的发展方向。

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