粗根荨麻提取物对环磷酰胺所致小鼠免疫功能低下保护作用的实验观察

李仲昆， 尹为民， 王崇静， 王 珩， 任晓明， 李 静， 蒋立虹*

(1.昆明市延安医院，云南昆明 650051;2.云南省第一人民医院 云南昆明 650032)

荨麻属植物在我国已有近千年的药用历史，国外从古罗马时期就开始药用，德国已经开发出治疗风湿、前列腺炎的产品，国外对大荨麻和异株荨麻进行了较系统的研究，发现其可以用来治疗前列腺增生、风湿性关节炎、过敏性鼻炎、高血压、心脏病、糖尿病，此外还具有抗病毒及免疫调节活性［1-3］。而我国目前尚无产品。研究论文都停留在抗炎方面，而对免疫调节方面的研究报道很少。本试验用环磷酰胺制备小鼠免疫功能低下的模型，然后给与口服粗根荨麻提取物，通过测定小鼠血清溶血素、白细胞介素2(IL-2)、γ-干扰素(IFN-γ)、T 淋巴亚群 CD3、CD4、CD8 的量，观察粗根荨麻的免疫调节作用。现报道如下。

1 材料

1.1 动物

ICR雄性小鼠120只，购自昆明医学院动物科，合格证号 SCXK(滇)2010-0008，体质量(20 ±2)g。

1.2 药物及主要试剂

1.2.1 受试物 粗根荨麻Urtica MacrorrhizaHand-Mazz:采自云南宾川鸡足山，由昆明植物所李锡文教授鉴定。

水提物的制备方法:将干燥后的粗根荨麻粉碎后，经过2次水提取，合并提取液，干燥后即得，一般可以得到10%的干燥品，即1 g相当于10 g生药。

粗多糖的制备方法:将干燥的水提物25 g，加水70 mL溶解，加95%乙醇350 mL，搅拌，倾去上层液体。沉淀加水50 mL溶解，加95%乙醇250 mL，搅拌，倾去上层液体，沉淀干燥后即得。可得9 g粗多糖，即1 g相当于28 g生药。

精制多糖的制备方法:将干燥的水提物25 g，加水70 mL溶解，加95%乙醇350 mL，搅拌，倾去上层液体。沉淀加水50 mL溶解，加95%乙醇250 mL，搅拌，倾去上层液体，此操作再重复2次，沉淀干燥后即得。可得6.5 g精制多糖，即1 g相当于38 g生药。

1.2.2 主要试剂 注射用环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司，09080521)。补体:抽取4只豚鼠心脏血，雌雄各半，分离新鲜血清，混合后备用，临用时生理盐水稀释1∶10。鸡红细胞(5%CRBC)，取新鲜鸡血，除去纤维蛋白，用生理盐水制备为5%CRBC悬液备用。IL-2、IFN-γ试剂盒，购于昆明晶美公司。流式试剂 Mouse CD3E PE-CY5，mouse CD4 FITC，mouse CD8-PE，为BD公司试剂。

1.3 主要仪器

紫外分光光度计(日本岛津UV-2401-PC)。酶标仪(美国Bio-RAD680)。流式细胞仪(美国BD公司)

2 方法

2.1 粗根荨麻对免疫低下小鼠血清溶血素的影响

2.1.1 模型制备［4］ICR雄性小鼠60只，随机分为5组:对照组，模型组，粗根荨麻A(水提物)、B(粗多糖)、C(精制多糖)组。实验开始后，粗根荨麻A、B、C组灌服药物，共给药7 d，给药剂量为0.5 g/kg。对照组、模型组每天灌服水0.3mL。对照组、模型组、粗根荨麻A、B、C组第1天腹腔注射5%CRBC悬液0.4mL，模型组、粗根荨麻A、B、C组在第2天腹腔注射环磷酰胺100 mg/kg。第8天按照2.1.2项下进行测定。

2.1.2 溶血素测定 给药后第8天摘取小鼠眼球取血，注入1.5 mL塑料离心管中，室温放置1 h，离心分离血清，取血清，用生理盐水稀释200倍，取稀释血清2.0 mL与5%鸡红细胞混悬液1.0 mL，10%补体血清1.0 mL混合，在37℃恒温箱孵育30 min，0℃冰箱中放置30 min终止反应，离心取上清液，在紫外分光光度计540 nm处，测吸光度OD值。以不加血清的空白对照管上清液作对照比色。

2.2 粗根荨麻对免疫低下小鼠 IL-2、IFN-γ、CD3、CD4、CD8的影响

2.2.1 模型制备［5-6］ICR 雄性小鼠60只，随机分为 5组:空白对照组(Control)、模型组(Model)，粗根荨麻A(水提物)、B(粗多糖)、C(精制多糖)组。实验开始后，粗根荨麻A、B、C组灌服药物，共给药7 d，给药剂量为0.5 g/kg。空白对照组、模型组每天灌服水0.3 mL。除空白对照组，其余各组在第2天腹腔注射环磷酰胺100 mg/kg。第8天取血。

2.2.2 测定:取血清按照小鼠酶联免疫(ELISA)IL-2、IFN-γ试剂盒使用说明操作，测定小鼠血清中IL-2、IFN-γ的水平。肝素抗凝血当天用流式法测定T细胞亚群。

3 结果

3.1 粗根荨麻提取物对免疫抑制小鼠血清溶血素的影响

粗根荨麻A、B、C均可对抗环磷酰胺所致小鼠血清溶血素水平的降低，与模型组比有显著差异。结果见表1。

3.2 粗根荨麻提取物对免疫抑制小鼠IL-2、IFN-γ的影响

粗根荨麻A、B、C可增加环磷酰胺小鼠血清IL-2、IFN-γ的水平。与模型组比较有显著差异。结果见表2。

表1 粗根荨麻提取物对免疫抑制小鼠血清溶血素试验结果

表2 粗根荨麻提取物对免疫抑制小鼠IL-2、IFN-γ的影响

3.3 粗根荨麻提取物对免疫抑制小鼠T细胞亚群的影响

模型组的CD3、CD4百分比均明显低于对照组(P＜0.05)，粗根荨麻 A、B、C 组的 CD3、CD4百分比均明显高于模型组(P＜0.05)。模型组与粗根荨麻A、B、C组比较，CD4/CD8明显偏低(P＜0.01)。见表3。

表3 粗根荨麻提取物对小鼠T细胞亚群的影响

4 讨论

体液免疫效应是由B细胞通过对抗原的识别、活化、增殖，最后分化成浆细胞并分泌抗体来实现的。血清中溶血素水平的高低是衡量体液免疫的重要指标。［7-9］

本试验结果表明灌服粗根荨麻组光密度值与环磷酰胺组相比显著提高，即血清溶血素水平升高，有显著差异，从而证明粗根荨麻对小鼠体液免疫功能具有显著促进作用。

本研究中，粗根荨麻组小鼠的IL-2和INF-γ水平显著高于模型组，说明粗根荨麻能提高小鼠的免疫防御功能。IL-2可诱导部分B细胞分泌生长因子以及造血因子，还能激活巨噬细胞，最终使免疫效应扩大和增强。INF-γ具有较强的免疫调节功能，能增强细胞功能，加快免疫复合物清除和提高吞噬异物功能，对淋巴细胞具有双向调节作用。

本研究中，模型组的总T淋巴细胞(CD3)及CD4百分比均明显低于对照组，说明环磷酰胺对小鼠细胞免疫功能有损伤。粗根荨麻A、B、C组的总T淋巴细胞(CD3)及CD4百分比均明显高于模型组，说明粗根荨麻对受损的小鼠细胞免疫功能有恢复作用。从CD4/CD8分析，模型组与粗根荨麻A、B、C组比较明显偏低，提示粗根荨麻可能通过提高CD4/CD8改善小鼠细胞免疫功能。

由此可见，粗根荨麻可以用于辅助治疗免疫功能低下导致的各种疾病，如过敏性疾病、肿瘤、糖尿病等。

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