注射用夏天无总碱对大鼠局灶性脑缺血的影响

姚丽梅， 刘 瑶， 段 启*

(1.广东食品药品职业学院，广东广州 510520;2.广东高校南药资源保护与利用工程技术开发研究中心，广东广州 510520)

夏天无为罂粟科植物伏生紫堇Corydalis decumbens(Thunb.)Pers.的干燥块茎，具有活血止痛、舒筋活络、祛风除湿的功效，临床主要用于中风偏瘫、头痛、跌扑损伤、风湿痹痛、腰腿疼痛［1］。夏天无的主要活性成分为生物碱，注射用夏天无总碱是从夏天无中提取的总生物碱制成的冻干粉针剂，我们在前期研究发现注射用夏天无总碱对沙鼠全脑缺血再灌注损伤具有治疗作用［2］。为进一步研究注射用夏天无总碱对脑缺血的治疗作用，本实验采用改良的大鼠大脑中动脉线栓模型，研究其对大鼠局灶性脑缺血的治疗作用，为临床研究提供充分的实验依据。

1 材料与方法

1.1 试验药物 注射用夏天无总碱(冻干粉针)，2 mg/瓶，由某制药有限公司提供，批号050508，试验前用0.9%氯化钠注射液配至所需浓度;灯盏细辛注射液，云南生物谷灯盏花药业有限公司生产，10 mL/支(含总黄酮45 mg)，批号20050322。

1.2 动物 雄性SD大鼠，SPF级，体质量(320±20)g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，合格证号:SCXK(沪)2003-0003。

1.3 仪器 LIBROR AEL-160电子分析天平(日本岛津公司);LXJ-IIB低速大容量离心机(上海安亭科学仪器厂);UV-260紫外可见分光光度计(日本岛津公司);LEICA RM2135切片机、LEICA HI1210漂片机、LEICA HI1220烤片机、LEICA EG1160包埋机(德国LEICA公司);YG-12T生物组织电脑脱水机(湖北阳光医疗有限责任公司)。

1.4 试剂 SOD、MDA试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号分别为20060217、20060411。

1.5 方法 取大鼠60只，随机分为6组，即注射用夏天无总碱高、中、低剂量组(剂量分别为 0.2、0.1、0.05 mg/kg)，灯盏细辛注射液组(剂量为9.0 mg/kg)，模型对照组和假手术组，每组10只。参照文献方法［3-4］，并加以改进制备大鼠大脑中动脉线栓模型。用10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，仰卧固定，常规消毒皮肤，颈部正中切开，钝性分离右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉。沿颈内动脉向下分离出翼腭动脉，于近分叉处结扎之。用动脉夹夹闭颈总动脉，于颈内动脉上(近颈总动脉分叉处)剪一切口，将一鱼线沿颈内动脉缓慢插入至大脑中动脉口，略感阻力时停止，插入长度约(18±0.5)mm，结扎固定鱼线。结扎颈内动脉近心端，取下动脉夹，恢复颈外动脉血流。整个手术过程注意避免损伤迷走神经。缝合肌肉皮肤，回笼饲养。假手术组大鼠分离右侧颈总动脉、颈内动脉及翼腭动脉，并结扎翼腭动脉，但不插鱼线阻断大脑中动脉。实验过程中死亡及癫痫发作者不计入试验。阻断大脑中动脉后即刻经尾静脉注射给药，给药容量均为2 mL/kg体质量，模型对照组和假手术组给等容量的生理盐水。

1.5.1 神经症状评分 参照文献方法［5-6］，按受损程度拟定神经症状评分等级。0级:无神经损伤症状;Ⅰ级:不能完全伸展左侧前爪;Ⅱ级:不能完全伸展左侧前爪，向左侧转圈;Ⅲ级:不能完全伸展左侧前爪，向左侧倾倒;Ⅳ级:不能自发行走，意识丧失。按上述标准，分别于阻断大脑中动脉后6 h及24 h采用单盲法对各组大鼠进行神经症状评分。

1.5.2 脑组织梗死范围测定 末次评分后，将大鼠断头取脑，去除嗅球、小脑和低位脑干，生理盐水洗净，滤纸吸尽水分，然后冠状切4刀，共5片。第二脑片留出供病理学检查，将其余4脑片置1%TTC磷酸盐缓冲液中37℃避光温孵10 min，洗去染色液，再用10%中性甲醛溶液固定24 h，取出观察拍照并称定质量，然后切取梗死区称定质量，以“重量求面积法”计算梗死组织质量占总脑中的百分比作为梗死面积。

1.5.3 血清SOD、MDA水平测定 末次评分后，水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉取血，离心分离血清，按试剂盒操作方法，比色法测定血清SOD活性、MDA水平。

1.5.4 组织病理学检查 第二脑片10%中性甲醛溶液固定，乙醇逐级脱水，HE染色，光镜观察大鼠脑组织病理变化。

2 结果

2.1 对神经症状评分的影响 给药后6 h，注射用夏天无总碱低剂量组大鼠神经损伤症状显著改善;给药后24 h，注射用夏天无总碱高、中、低剂量组大鼠神经症状均显著改善，见表1。

表1 注射用夏天无总碱对大鼠局灶性脑缺血神经损伤症状的影响 (n=10)

2.2 对梗死范围的影响 注射用夏天无总碱高、中剂量组大鼠脑梗死质量及梗死范围均明显减小，见表2。

表2 注射用夏天无总碱对大鼠局灶性脑缺血脑组织梗死范围的影响 ( ±s，n=10)

表2 注射用夏天无总碱对大鼠局灶性脑缺血脑组织梗死范围的影响 ( ±s，n=10)

与模型对照组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01(下同)。

组别 剂量/(mg/kg)梗死质量×10－2/g梗死范围/%假手术组 生理盐水 — —模型对照组 生理盐水 21.20±9.62 17.43±7.08注射用夏天无总碱 0.2 9.49 ±3.76＊＊ 7.99 ±3.60＊＊注射用夏天无总碱 0.1 10.43 ±6.43* 9.21 ±5.48*注射用夏天无总碱 0.05 19.94 ±12.90 16.57 ±10.47灯盏细辛注射液组 9.0 9.05 ±3.13＊＊ 8.00 ±4.01＊＊

2.3 对血清SOD、MDA的影响 注射用夏天无总碱高、中、低剂量组大鼠血清SOD活性显著升高;注射用夏天无总碱高、中剂量组大鼠血清MDA水平明显下降，见表3。

表3 注射用夏天无总碱对大鼠局灶性脑缺血血清SOD、MDA 水平的影响 (±s，n=10)

表3 注射用夏天无总碱对大鼠局灶性脑缺血血清SOD、MDA 水平的影响 (±s，n=10)

组别 剂量/(mg/kg)SOD/(U/mL)MDA/(nmol/mL假手术组 生理盐水 332.64 ±38.60＊＊ 4.21 ±0.40)＊＊模型对照组 生理盐水 260.18 ±21.13 6.09 ±1.23注射用夏天无总碱 0.2 340.62 ±42.36＊＊ 4.21 ±0.72＊＊注射用夏天无总碱 0.1 323.49 ±46.89＊＊ 4.43 ±0.67＊＊注射用夏天无总碱 0.05 330.81 ±43.71＊＊ 5.20 ±1.27灯盏细辛注射液组 9.0 324.65 ±44.50＊＊ 4.20 ±0.73＊＊

2.4 组织病理学检查结果 模型对照组大鼠脑组织充血，部分出现小灶出血，局部神经细胞排列紊乱，灰质区局部神经细胞、胶质细胞出现轻度核固缩和轻度细胞坏死、消失，白质区局部神经纤维束轻度液化坏死。假手术组部分大鼠脑组织轻度充血，其余未见明显改变。注射用夏天无总碱高剂量组部分大鼠脑组织轻度充血，少数大鼠灰质区局部神经细胞轻度排列紊乱，部分神经细胞、胶质细胞出现核固缩和轻度细胞坏死消失，白质区局部神经纤维束轻度液化坏死。注射用夏天无总碱中、低剂量组大鼠脑组织轻度充血，部分大鼠局部神经细胞轻度排列紊乱，局部胶质细胞轻度核固缩和坏死消失，白质区局部神经纤维束轻度液化坏死。注射用夏天无总碱各剂量组脑组织病变均比模型对照组轻，其中高剂量组病变最轻。灯盏细辛注射液组部分大鼠脑组织轻度充血，少数大鼠灰质区局部神经细胞轻度排列紊乱，部分神经细胞、胶质细胞出现核固缩和轻度细胞坏死消失，白质区局部神经纤维束轻度液化坏死。组织病理学半定量结果见表4。

表4 注射用夏天无总碱对大鼠局灶性脑缺血脑组织病理检查半定量结果

3 讨论

缺血性脑血管疾病是现代医学的高发病之一，其发病凶险，致残、致死率高，可导致严重的迟发性神经元损伤，影响患者的预后和功能恢复，严重危害人们的健康。临床上脑缺血多见于大脑中动脉，因此使用大鼠大脑中动脉线栓法制备脑缺血模型，能较真实地模拟临床状态，且该模型操作简便，无需开颅，缺血部位较恒定，脑梗死范围差异较小，被广泛用于研究药物脑保护作用［7-12］。既往已有研究报道［13］夏天无总碱口服对脑缺血/再灌注损伤有保护作用，其作用机制与抑制NOS活性、提高SOD活性、减少神经细胞脂质过氧化损伤和抑制神经细胞凋亡有关。本试验采用大鼠大脑中动脉线栓模型观察注射用夏天无总碱对脑缺血的治疗作用，通过改变剂型及给药途径，给药剂量大为降低，可减弱夏天无总碱中个别成分对机体潜在的不良作用。

自由基在缺血缺氧性脑损伤的病理生理机制中发挥了重要的作用，正常生物体内自由基生成与清除处于动态平衡，脑缺血时，大量的自由基生成，使脑内脂质过氧化作用加强，导致细胞及细胞屏障损害，神经元坏死或凋亡，引起和加重缺血脑组织水肿［14］。SOD是体内主要的自由基清除剂，可催化超氧自由基发生歧化反应，生成过氧化氢和氧，而超氧自由基的产生是其他自由基产生和增殖的关键步骤。MDA是脂质过氧化反应的最终产物，MDA水平间接反映了组织中自由基含量及脂质过氧化程度。因此，测定这些物质的活性或含量变化可以间接反映药物抗脑缺血损伤作用的强弱。

本实验结果表明，注射用夏天无总碱能显著改善局灶性脑缺血大鼠神经损伤症状，减小梗死范围，降低血清MDA含量，增强血清SOD活性，改善缺血脑组织病理变化，对局灶性脑缺血损伤具有明显的治疗作用。

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