高效液相色谱法测定穿龙骨刺片中薯蓣皂苷和淫羊藿苷

张伏军， 尹小玲， 李 卿， 秦 剑

（1.重庆三峡中心医院药剂科，重庆404000；2.重庆市中药研究院，重庆 400065）

高效液相色谱法测定穿龙骨刺片中薯蓣皂苷和淫羊藿苷

张伏军1， 尹小玲1， 李 卿2， 秦 剑2

（1.重庆三峡中心医院药剂科，重庆404000；2.重庆市中药研究院，重庆 400065）

目的 测定穿龙骨刺片（穿山龙，淫羊藿，狗脊，川牛膝，熟地黄，枸杞子）中薯蓣皂苷、淫羊藿苷。方法 采用高效液相色谱法，色谱柱为C18柱，以乙腈-水为流动相，检测波长为203 nm（薯蓣皂苷）、270 nm（淫羊藿苷）。结果 薯蓣皂苷进样量、淫羊藿苷进样量分别在0.56～5.60 μg、0.24～2.40 μg范围内与其峰面积积分值呈良好线性关系（r分别为0.999 9、0.999 8）；平均回收率分别为 98.23%、98.34%，RSD 分别为 0.88%（n=6）、0.62%（n=6）。结论 HPLC 法快速、准确，可用于该制剂的质量控制。

薯蓣皂苷；淫羊藿苷；穿龙骨刺片；HPLC

穿龙骨刺片收载于《卫生部药品标准·中药成方制剂》第十四册，处方由穿山龙、淫羊藿、狗脊、川牛膝、熟地黄、枸杞子组成，具补肾，健骨，活血，止痛功效。临床用于骨质增生，骨刺疼痛等症。文献报道该制剂质量控制和定量测定方法多采用高效液相色谱法测定淫羊藿中淫羊藿苷［1-3］；穿山龙作为方中君药，有祛风除湿，舒筋通络，活血止痛作用［4］，含多种甾体皂苷，薯蓣皂苷的质量分数约1.5% ～2.6%，是穿山龙药材中主要成分。目前国内生产穿龙骨刺片的企业较多，为有效监测制剂质量，进一步提高品种的质量标准，建立方中君臣药主要成分的定量方法，对该制剂的质量控制和产品规范十分必要。本实验采用高效液相色谱法测定穿龙骨刺片中薯蓣皂苷、淫羊藿苷，快速，准确，重现性好，专属性强，可用于该制剂的质量控制和评价指标。

1 仪器与试药

Waters 2695型高效液相色谱仪、2996二极管阵列检测器；AE-240S型电子天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；KQ-50B型超声波清洗器（120W，40KHZ；昆山市超声仪器有限公司）；薯蓣皂苷对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号：111701-200501）；淫羊藿苷对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号：110737-200312）水为去离子水，乙腈为色谱纯；其余试剂均为分析纯；穿龙骨刺片（市售产品，批号：100901，100910，101001）。

图1 高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms

2 薯蓣皂苷测定

2.1 色谱条件 色谱柱Symmetry C18柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈-水（26 ∶74）为流动相；体积流量1.0 mL/min；检测波长为203 nm；柱温30℃。理论板数按薯蓣皂苷峰计算应不低于3 000。

2.2 供试品溶液的制备 取本品10片，精密称定，研细，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇40 mL，超声处理（功率120 W，频率40 KHZ）30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水30 mL使溶解，过D101大孔树脂柱（3g，Φ0.9 cm），用水60 mL 洗脱，弃去水洗液，再用80%乙醇35 mL洗脱，收集乙醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，取续滤液，即得。

2.3 对照品溶液的制备 取薯蓣皂苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.28 mg的溶液，即得。

2.4 阴性对照溶液的制备 按处方量并以相同工艺制备阴性对照（缺穿山龙）样品，照上述供试品溶液制备方法处理，得阴性对照溶液。

2.5 系统适用性试验 精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL，进样，记录色谱图，测定结果，阴性对照色谱中，在与薯蓣皂苷对照品及供试品色谱相应保留时间处无相应色谱峰，表明其他组分对测定薯蓣皂苷成分无干扰，分离度大于1.5，见图1。

2.6 线性关系考察 精密吸取对照品溶液2、4、8、16、20 μL，进样，以薯蓣皂苷峰面积积分值为纵坐标，进样量（μg）为横坐标，进行回归分析，薯蓣皂苷进样量在0.56～5.60 μg范围内与峰面积积分值线性关系良好，得回归方程：Y=261 285X－106 127（r=0.999 9）。

2.7 精密度试验 精密吸取同一对照品溶液，重复进样6次，测定薯蓣皂苷，其峰面积积分值相对标准偏差（RSD）为0.75%（n=6）。

2.8 稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别于0、2、4、8、14 h 进样，测定，薯蓣皂苷峰面积积分值的相对标准偏差（RSD）为0.92%。表明供试品溶液在14 h内基本稳定。

2.9 重复性试验 取同一批样品6份，精密称定，照供试品溶液制备方法，测定，计算薯蓣皂苷量，结果样品中含薯蓣皂苷平均为0.21 mg/片，相对标准偏差（RSD）为1.01%（n=6）。表明效果良好。

2.10 加样回收率试验 取已测定的同批样品6份（含薯蓣皂苷为 0.21 mg/片），各约 0.25 g，精密称定，分别精密加入薯蓣皂苷对照品甲醇溶液（0.14 mg/mL）8、10、12 mL，照供试品溶液制备方法处理，进样，记录色谱图，计算回收率，结果平均回收率为98.23%，RSD 为0.88%，表明回收率良好，见表1。

表1 加样回收率试验结果 （n=6）Tab.1 Results of revovery test（n=6）

2.11 样品测定 取不同批次穿龙骨刺片样品各3份，按供试品溶液制备方法制备样品溶液，分别精密吸取对照品溶液 5 μL、20 μL 及供试品溶液 10 μL，测定，用外标两点法方程计算薯蓣皂苷量，结果见表2。

表2 样品测定结果 （n=3）Tab.2 Results of contents determination （n=3）

3 淫羊藿苷测定

3.1 色谱条件 色谱柱 Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈-水（30 ∶70）为流动相；体积流量0.8 mL/min；检测波长为270 nm；柱温30℃。理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于3 000。

3.2 供试品溶液的制备 取本品10片，精密称定，研细，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇45 mL，超声处理（功率120 W，频率40 KHZ）30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水30 mL使溶解，用乙酸乙酯振摇提取4次，每次30 mL，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，取续滤液，即得。

3.3 对照品溶液的制备 取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.12 mg的溶液，即得。

3.4 阴性对照溶液的制备 按处方量并以相同工艺制备阴性对照（缺淫羊藿）样品，照上述供试品溶液制备方法处理，得阴性对照溶液。

3.5 系统适用性试验 精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL，进样，记录色谱图。测定结果：阴性对照色谱中，在与淫羊藿苷对照品及供试品色谱相应保留时间处无相应色谱峰，表明方中其他组分对测定淫羊藿苷成分无干扰，且分离度大于 2.0，见图 2。

3.6 线性关系考察 精密吸取对照品溶液2、4、8、16、20 μL，进样，以淫羊藿苷峰面积积分值为纵坐标，进样量（μg）为横坐标，进行回归分析，淫羊藿苷进样量在0.24～2.40 μg范围内与峰面积积分值线性关系良好，得回归方程：Y=1 925 482X－98 456.5（r=0.999 8）。

图2 高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatograms

3.7 精密度试验 精密吸取同一对照品溶液，重复 进样6次，测定淫羊藿苷，其峰面积积分值相对标准偏差（RSD）为0.80%（n=6）。

3.8 稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别于0、1、4、8、10、14 h 进样，淫羊藿苷峰面积积分值相对标准偏差（RSD）为0.73%。结果供试品溶液在14 h内基本稳定。

3.9 重复性试验 取同一批样品6份，精密称定，照供试品溶液制备方法，测定，计算淫羊藿苷，结果样品中含淫羊藿苷平均为1.16 mg/片，相对标准偏差（RSD）为0.97%（n=6）。表明方法重复性良好。

3.10 加样回收率试验 取已测定的同批样品6份（含淫羊藿苷为 1.16 mg/片），各约 0.25 g，精密称定，分别精密加入淫羊藿苷对照品甲醇溶液（0.029 mg/mL）16、20、24 mL，照供试品溶液制备方法处理，进样，记录色谱图，计算回收率，结果平均回收率为98.34%，RSD为0.62%，表明回收率良好，见表3。

表3 加样回收率试验结果 （n=6）Tab.3 Results of revovery test（n=6）

3.11 样品测定 取不同批次穿龙骨刺片样品各3份，按供试品溶液制备方法制备样品溶液，分别精密吸取对照品溶液 5 μL、20 μL 及供试品溶液 10 μL，测定，用外标两点法方程计算淫羊藿苷量，结果见表2。

4 讨论

采用高效液相色谱法测定穿龙骨刺片中薯蓣皂苷，尚未见文献报道。测定该品种中薯蓣皂苷和淫羊藿苷，方法简便、准确，重现性良好，为该制剂的质量控制和检测方法提供了理论依据。

由于产品制备工艺采用部分生药细粉入药，其余药材为水提取物制备而成，供试品溶液的提取如果采用溶剂直接超声处理［5-7］，将会对色谱柱的柱效产生大的损伤，参考文献［8-10］，对测定淫羊藿苷的样品溶液进行纯化比较试验，聚酰胺柱层析法、乙酸乙酯提取法、大孔树脂吸附法，试验结果以乙酸乙酯提取法操作简单，快速，供试品溶液纯化效果明显；并对乙酸乙酯提取次数进行了研究，发现乙酸乙酯提取4次后，残留样品未能检测有淫羊藿苷目标峰，故选择乙酸乙酯提取4次为宜；且对淫羊藿苷定量测定进行了方法学考察，结果表明本方法可以用于制剂中淫羊藿苷的定量测定。

高效液相色谱法测定制剂中薯蓣皂苷，对供试品提取、纯化方法进行比较。由于供试品中穿山龙药材部分为原生药粉末，故采用甲醇提取；另对采用超声提取法与回流提取法作比较，结果显示超声处理与回流提取差别不大，为了提取完全并省时节能，故选用甲醇超声提取法；结合文献报道方法［11-13］，对供试品采用D101型树脂、AB-8型树脂、D201型树脂进行纯化对比试验，结果表明，应用D101型树脂纯化效果明显，吸附率和解吸率优于其它类型树脂，能够纯化供试品溶液，通过定量测定方法学考察，结果比较满意。

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Determination of dioscin and icariin in Chuanlong Guci Tablet by HPLC

ZHANG Fu-jun1， YIN Xiao-ling1， LI Qing2， QIN Jian2

（1.Chongqing Three Gorges Central Hospital，Chongqing 404000，China；2.Chonging Academy of Chinese Materia Medica，Chongqing 400065，China）

AIMTo determine the contents of dioscin and icariin in Chuanlong Guci Tablet（Dioscoreae nipponicae Rhizoma，Epimedii Folium，Cibotii Rhizoma，Cyathulae Radix，Rehmanniae Radix Praeparata，Lycii Fructus）.METHODSHPLC method was adopted and a C18column was used.The mobile phase was acetonitrile-water.The detection wavelengths were set at 203 nm（dioscin）、and 270 nm（icariin）.RESULTSThe linear ranges were 0.56-5.60 μg（r=0.999 9）for dioscin，0.24-2.40 μg（r=0.999 8）for icariin，respectively.Their average recoveries were 98.23%（RSD was 0.88%），98.34%（RSD was 0.62%）.CONCLUSIONThe method is quick and accurate，and it can be used for quality control of Chuanlong Guci Tablet.

dioscin；icariin；Chuanlong Guci Tablet；HPLC

R927.2

A

1001-1528（2011）07-1182-04

2011-03-06

张伏军（1978—），男，主管药师，从事临床药学药事管理。Tel：15978923366