指纹图谱法优选诃子提取工艺的研究

刘雅敏， 郭丹丹， 杨 晋， 张正伟， 刘延泽

（1.河南中医学院，河南 郑州450008；2.北方民族大学化工学院，宁夏 银川750021；3.洛阳市中心医院，河南洛阳 471000）

指纹图谱法优选诃子提取工艺的研究

刘雅敏1， 郭丹丹1， 杨 晋2， 张正伟3， 刘延泽1

（1.河南中医学院，河南 郑州450008；2.北方民族大学化工学院，宁夏 银川750021；3.洛阳市中心医院，河南洛阳 471000）

目的 优选诃子有效部位的提取工艺参数。方法 运用正交L8（27）实验，以各提取实验条件的HPLC指纹图谱色谱峰面积的变化量和相似度为指标，考察提取工艺条件。结果 优化的诃子提取工艺参数为药材粒度60目、70%乙醇、8倍溶剂量、浸渍提取3次，每次30 min。结论 指纹图谱技术可以作为工艺筛选过程中的有效评价手段。

诃子；提取工艺；指纹图谱

诃子为使君子科榄仁属植物诃子Terminalia chebulaRetz.及其变种绒毛诃子Terminalia chebulaRetz.var.tomentellaKurt.的干燥成熟果实，具有涩肠止泻、敛肺止咳、降火利咽、调和药性、解毒等功效［1］。现代研究显示，诃子具有抗氧化、抗菌、抗病毒、强心、抗诱变、抗癌、抗阿米巴原虫、抗动脉粥样硬化以及强心作用等药理作用［2-3］，这些作用主要集中于可水解丹宁类成分［4］。目前在诃子提取工艺研究中，多采用总丹宁成分量作为工艺优选指标。但这类成分化学稳定性差，总丹宁量变化不能全面反映出工艺因素对药材中丹宁类成分的提取率以及稳定性的影响，因而无法得出真正的最佳提取工艺条件，也使制剂质量难以进行标准化控制。目前指纹图谱被认为是能够较全面地反映药材提取物质量变化的质控技术。故本实验以选定指纹图谱色谱峰面积的变化量和相似度为指标，以诃子中的主要有效成分和特征性成分诃子酸（chebulinic acid）［5］为参照物，采用多指标综合评分法优选提取工艺参数，为保证诃子提取物的质量，制备出诃子标准提取物奠定了基础。

1 实验材料

1.1 仪器 LC-2010A高效液相色谱仪（日本岛津）；DiamonsilTMC18柱（4.6 mm ×250 mm，5μ m）；工作站：CBM-102（日本岛津）；检测器：SPD-20A（日本岛津）；中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（版本2004A）（中国药典委员会推荐）。

1.2 试剂 诃子酸对照品由刘延泽教授提供，经光谱鉴定、HPLC检测纯度在95%以上；甲醇为色谱纯，其它试剂均为分析纯。柱层析用吸附剂Toyopearl HW-40（C）为日本Tosoh公司产品。

1.3 药材 诃子，产地云南，由陈随清教授鉴定为使君子科植物诃子Terninalia chebulaRetz.。

2 实验方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为DiamonsilTMC18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相采用线性梯度洗脱，A相为甲醇，B相为0.5%的冰醋酸水溶液，体积流量1.0 mL/min，SPD-20A 检测器，柱温30 ℃，波长254 nm，分析时间60 min。线性梯度洗脱程序见表1。

表1 线性梯度洗脱程序

2.2 提取因素水平的确定 用浸渍法进行提取。实验因素水平见表2。

2.3 正交实验方案设计 采用正交实验表L8（27）设计实验方案。

2.4 提取液的制备［5］称取诃子粗粉8份，每份10 g，精密称定，分别按照2.3项条件提取，过滤，合并提取液，定容至500 mL，备用。精密量取各正交实验条件下提取液10 mL，挥干溶剂，以70%丙酮定容于100 mL量瓶中，于60℃减压浓缩至5 mL，上ToyopearlHW-40（C）柱（1 cm，柱长20 cm，吸附剂高10 cm）进行柱层析，依次用蒸馏水50 mL、5%甲醇50 mL洗脱除去杂质，然后用甲醇-丙酮-水（6∶2∶2）300 mL洗脱（至洗脱液三氯化铁-铁氰化钾薄层显色反应为阴性），所得洗脱液于60℃减压浓缩至干，用甲醇溶解并定容于10 mL量瓶中，经0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液进样10 μL进行HPLC分析，选定的色谱峰面积结果见表3。

表2 因素水平

另称取诃子粗粉10 g，用70%丙酮提取3次，每次150 mL，过滤，合并提取液，定容至500 mL。余操作同上，取续滤液进样10 μL进行HPLC分析，以选定色谱峰面积作为单宁类成分近似完全浸出的基准。

表3 指标峰峰面积值

2.5 对照品溶液的制备与测定 精密称取诃子酸对照品1.19 mg，置1 mL量瓶中，甲醇溶解并定容，制成对照品溶液。精密吸取对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪，测定，作为对照。

2.6 诃子提取工艺与HPLC图谱的相关性 通过指纹图谱分析软件，把诃子各提取工艺条件下的色谱图重叠比较；然后求得各提取工艺与70%丙酮提取结果的相似度K。结果见表4、表7、表8。

2.7 结果分析 选定正交表各个实验指纹图谱当中13个共有色谱峰的峰面积作为提取工艺的评价指标，采用多指标综合评分法进行数据标准化综合处理［6］。以Xij表示正交实验的第i次实验的色谱图中第j个色谱峰峰面积值，以各指标的最大值（Xj）max（即各色谱图中同一相对保留时间的各色谱峰中峰面积值最大者）作为参照，对同一指标各数据进行标准化处理，Dij表示第j个指标下的第i个测定值的标准化数据。

再按各指标的重要程度和各组数据的相对标准差确定加权系数。以SDj表示第j个指标下Dij的标准差，以RSDj表示第j个指标的相对标准差，然后再根据各指标相对标准差赋权RSD/RSDj，其中RSD为指定指标（参照物诃子酸）的相对标准差；根据各指标的重要程度赋权为Ej，由于要全面考虑到诃子中的各个组分，故认为指纹图谱中的各个色谱峰（群）所代表的各组分（群）都很重要，均设为1即Ej=1。结合各指标的重要程度和各组数据的相对标准差确定的权重系数为：

因此，多指标实验公式为：

设P9为1，则其余各实验丹宁提取率为

［4］式计算所得为兼顾各指标综合效应结果，得分越大越好。对所得数据进行直观分析和方差分析。结果见表4～8。

以提取率为指标时，诃子的粒度、乙醇浓度、提取时间、乙醇浓度与提取次数的相互作用对诃子指纹图谱所指定的13个色谱峰峰面积变化有显著影响。各因素对测定结果的影响次序为B＞D＞A＞E＞C。由于B、E的交互作用显著，根据表4得B2E2为最优搭配。以相似度为指标时，溶剂量对各实验条件下所提成分与丙酮提取物的相似性有显著影响。综合上述分析结果，确定优化的提取工艺条件为A2B2C1D2E2，即诃子粉碎粒度60目、乙醇浓度70%、8倍溶剂量、搅拌提取3次、每次30 min。

表4 正交实验方案与结果

表5 提取率交互作用

表6 提取率方差分析

表7 相似度交互作用

表8 相似度方差分析

2.8 验证实验 按照优选出的最佳工艺条件，用同一批药材重复提取3次，实验结果按照2.7项下方法进行数据处理，结果见表9。

表9 验证试验

表明此提取工艺合理可行、稳定。

3 讨论

3.1 诃子中的有效成分丹宁为多羟基化合物，该类成分在光照和高温条件下不稳定，极易发生结构降解。成分稳定性差的特点限制了它的制剂开发。在对诃子中的丹宁成分进行提取时，应控制好提取的温度和时间，力求快速、完全，以达到不破坏丹宁类成分之目的。所以我们选用多重冷浸并搅拌提取的方法，通过正交实验考察粒度、乙醇浓度、溶剂量、搅拌时间、提取次数等因素，最终确定最优提取条件为：将诃子粉碎成60目粗粉，8倍量70%乙醇提取3次，每次30 min。

3.2 对于丹宁类成分，目前公认70%丙酮是提取率高、使结构保持较好稳定性的提取溶剂，故本实验将其提取物的指纹图谱总峰面积作为比较丹宁类成分提取率的基准，以及提取条件对丹宁成分结构变化（相似度）的比较基准。但是由于丙酮的毒性和价格原因，不宜作为诃子总丹宁工业化提取的溶剂［5，7-8］，因此本实验采用乙醇为提取溶剂，结果表明提取效果与丙酮相接近。

3.3 对于成分复杂的中药制剂，在其制剂工艺研究中，仅仅考察单一指标性成分或总成分的提取率，往往不能够全面反映制剂工艺因素对总体有效成分的含量与稳定性的影响，因而也就不能真正找到合理的制剂工艺条件，无法做到制剂质量的稳定可控。指纹图谱技术是目前认为比较能反映中药制剂综合成分状态的质量控制方法，其用于中药制剂工艺还处于探索阶段。本研究用诃子提取工艺的HPLC指纹图谱特征色谱峰的面积变化量，以及与70%丙酮提取物的色谱峰相似度作为评价指标，基本能够体现工艺条件对诃子中有效成分的提取效果的全面影响，准确说明该工艺的优劣，最大限度地保留诃子中的有效成分，从而更加全面的体现诃子自身的药理活性，保证成品的质量。

［1］赵国平，戴 慎，陈仁涛.中药大辞典：上［M］.2版.上海：上海科技出版社，2006.1641.

［2］刘玉梅，宋宝安.诃子化学成分与生物活性的研究进展［J］.贵州大学学报，2007，2（2）：208-212.

［3］张庆容，田 红.诃子的药理活性研究进展［J］.国外医药，植物药分册，2004，19（6）：237-240.

［4］石 碧，狄 莹.丹宁的药理活性［J］.中草药，1998，29（7）：487-490.

［5］丁 岗，刘延泽.不同来源诃子中3种可水解丹宁的定量分析［J］.中药材，2000，23（6）：329-331.

［6］韩可勤，杨静化，刘晓东.药学应用概率统计［M］.南京：东南大学出版社，2000：1301.

［7］匡海学.中药化学［M］.北京：中国中医药出版社，2003：378-379.

［8］黄朝生，彭 轩.某市54家企业有机溶剂职业危害情况调查［J］.中国热带医学，2005，5（5）：1093-1094.

R944.2+7

A

1001-1528（2011）07-1168-04

2010-08-31

河南省科技攻关项目（524410076）

刘雅敏（1960—），教授，研究方向：中药固体制剂技术。Tel：（0371）65575822，E-mail：lymll2001@yahoo.com.cn