大孔吸附树脂富集纯化竹节参总皂苷工艺条件优选

欧阳丽娜， 吴 雪， 李兰林， 孙晓博， 向大雄*

（1.中南大学湘雅二医院天然药物研究室，湖南 长沙 410011；2.岳阳市一人民医院药剂科，湖南 岳阳414000；3.北京市积水潭医院，北京， 100035）

大孔吸附树脂富集纯化竹节参总皂苷工艺条件优选

欧阳丽娜1，2， 吴 雪1，3， 李兰林1， 孙晓博1， 向大雄1*

（1.中南大学湘雅二医院天然药物研究室，湖南 长沙 410011；2.岳阳市一人民医院药剂科，湖南 岳阳414000；3.北京市积水潭医院，北京， 100035）

目的 研究大孔吸附树脂富集纯化竹节参中总皂苷的工艺条件及参数。方法 以竹节参总皂苷的吸附量和洗脱率为指标，筛选大孔吸附树脂，并研究所选树脂富集纯化竹节参总皂苷的吸附和洗脱条件。结果 D101树脂对竹节参总皂苷有较好的吸附分离性能。最佳工艺条件为上样质量浓度为0.2 g生药/mL，以3BV 70%乙醇溶液洗脱，吸附及洗脱体积流量均为1 mL/min，洗脱液蒸干，即得纯化的竹节参总皂苷提取物。纯化后竹节参总皂苷质量分数为82.53%，精制度达338.81%。结论 D101大孔吸附树脂富集纯化竹节参中总皂苷是可行的。

竹节参；总皂苷；大孔吸附树脂；纯化

竹节参Panacis japonici Rhizoma为五加科Araliaceae植物竹节参Panax japonicusC.A.Mey.的干燥呈竹鞭状根茎，广泛分布于日本及中国西南至中部地区［1］。其性温、味甘、微苦，具有滋补强壮、散瘀止痛、止血祛痰等功效［2］，兼具我国北药人参和南药三七的功用，享有“土家族神参”的美誉。现代药理学研究表明，竹节参中研究最多、功效最显著的为皂苷类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤以及降血糖等药理活性［3-6］，因此，加强对其开发与利用具有十分重要的现实意义。

大孔吸附树脂（Macro Absorption Resin）为一种选择性有机高聚吸附剂，具有吸附快、解吸快、吸附容量大、易于再生、使用寿命长等优点。近年来已广泛应用于天然产物的分离与富集，尤其适用于水溶性化合物，如皂苷、黄酮及生物碱等的分离与富集，但在竹节参总皂苷（Total saponins ofPanax japonicusC.A.Mey.，TsPJ）纯化工艺方面尚未见报道。本实验旨在探讨大孔吸附树脂富集、纯化竹节参总皂苷的工艺条件和参数，从而确立富集、纯化竹节参总皂苷的可行方法，为其开发应用提供实验依据。

1 材料及仪器

竹节参药材（购于湖北恩施圣丰药业）；人参皂苷Re对照品（购自中国药品生物制品检定所，批号为754-9204）；乙醇、香草醛、高氯酸、冰醋酸均为分析纯，水为双蒸水。

HPD-100型大孔树脂购自沧州宝恩大孔树脂有限公司；D101、AB-8、LX-68型大孔树脂购自西安蓝晓科技有限公司；S-8型大孔树脂购自南开和成科技有限公司。

SPECORD50型紫外-可见分光光度计（德国耶拿分析仪器股份公司），恒温水浴锅（上海医疗器械五厂），分析天平（METTLER公司），RE52-98旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），NJL07-3型微波提取器（南京杰全微波设备有限公司），YB-Z真空恒温干燥箱（天津药典标准仪器厂）。

2 方法与结果

2.1 竹节参总皂苷的测定

2.1.1 标准曲线的绘制［7-8］

精密称定人参皂苷Re对照品4.59 mg，加甲醇溶解，定容至5 mL，得0.918 mg/mL的对照品溶液。

用20～200 μL可调微量取样器吸取制备好的人参皂苷 Re 标准溶液 40、80、120、160、200 μL 于10 mL具塞试管中，70℃水浴蒸干，于每个试管中加新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，摇匀，置 60 ℃水浴上加热15 min，流水冷却，准确加入冰醋酸5 mL，摇匀，以分光光度计在552 nm波长测定吸光度值（A）。以吸光度值（X）为横坐标，以人参皂苷Re的量（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=0.272 3X+0.001 6，相关系数R2=0.999 3，表明人参皂苷 Re在 55.08 ～219.44 μg与吸光度的线性关系良好。

2.1.2 样品液的制备与总皂苷的测定

取竹节参药材粉末1 000 g，预先浸渍12 h，以80%乙醇为提取溶剂，料液比为1∶18，功率为300 W提取4次，每次5 min，趁热过滤，合并提取液，回收乙醇。向提取液中加入适量活性炭，使其浓度达到1%左右，加热并保持75℃，磁力搅拌30 min进行脱色处理，趁热过滤，将滤液用蒸馏水定容至5 000 mL作为储备上样液（0.2 g生药/mL），放置冰箱冷藏。

精密吸取竹节参样品液5 mL，用水饱和正丁醇萃取3次，每次5 mL，合并正丁醇层，水浴挥干，甲醇溶解并定容至50 mL，精密吸取上述溶液50 μL，按2.1.1项下操作，测定吸收值，计算总皂苷量，结果平均为 24.32 mg/mL，RSD 为 2.54%（n=6）。

2.2 大孔树脂型号选择

取预处理好的湿树脂抽滤，除去水分后，精确称取5.00 g，置于具塞三角瓶中，准确加入用贮备液稀释所得竹节参总皂苷样品溶液（0.1 g生药/mL）50 mL，室温放置，每隔10 min振摇1次，持续4 h，使树脂充分吸附TsPJ，过滤，测定滤液中TsPJ浓度，计算各种树脂的静态饱和吸附量。同时将吸附饱和的树脂滤除水分，放入具塞三角瓶中，准确加入50 mL 95% 的乙醇，室温放置，每隔10 min振摇1次，持续4 h，使TsPJ充分解析，过滤，测定滤液中TsPJ浓度，并计算各种树脂的静态解析率，结果见表1。

虽然S-8型大孔树脂静态吸附量较D101型大孔树脂大，但解析率却不及后者；相比于其它类型大孔吸附树脂，D101树脂对TsPJ有着相对较高静态吸附量和静态解析率，故选择D101大孔树脂进行动态吸附-洗脱性能的研究。

表1 不同树脂静态吸附量和解析率的比较Tab.1 Adsorption and desorption of iridoid with different marcroporous resin

2.3 D101型大孔吸附树脂对TsPJ动态吸附洗脱参数考察

2.3.1 上样液质量浓度对吸附的影响

精确称取20.00 g已处理好的树脂装柱，径高比约1∶10。分别配制一系列不同质量浓度的竹节参总皂苷样品溶液，将之以不同的体积分别加到树脂柱中，收集过柱残液和水洗液，测定其中皂苷的量，计算比吸附量，结果见表2，确定最佳上样质量浓度为0.2 g生药/mL。

表2 上样液质量浓度对比吸附量的影响 （n=3）Tab.2 The effect of concentration of feed on adsorption amount

2.3.2 吸附流量对吸附容量的影响

精确称取20.00 g已处理好的树脂装柱，径高比约1∶10。分别控制不同上样流量，收集过柱残液和水洗液，并测定其中皂苷的量，计算比吸附量，结果见表3。确定样液的最佳吸附流速为1 mL/min。

表3 吸附流量对比吸附量的影响 （n=3）Tab.3 The effect of feed rate on adsorption amount（n=3）

2.3.3 上样液pH值对吸附的影响

精确称取20.00 g已处理好的树脂装柱，径高比约1 ∶10。上样液的 pH 值分别调为 4、5、6、7、8，收集过柱残液和水洗液，测定其中皂苷的质量浓度，计算比吸附量，结果见表4。三萜皂苷作为一种弱酸性化合物，在弱酸性溶液中以分子形式存在，有利于树脂的吸附。因此上样液的pH值宜控制在6左右。

表4 上样液pH值对比吸附量的影响 （n=3）Tab.4 The effect of feed pH value on adsorption amount（n=3）

2.3.4 泄漏曲线的考察

精密吸取250 mL上样液进行上柱。分段收集流出液，每25 mL收集，收集10份。测定过柱液中皂苷质量浓度，结果见图1。

图1 泄漏曲线的考察Fig.1 The leak of sample

从图中可知，当过柱液体积增加到50 mL时，D101大孔吸附树脂对TsPJ的吸附逐渐趋于饱和，TsPJ开始明显泄漏。故认为样液的最佳上样体积不超过50 mL，即上样比不超过60.79 mg/g树脂。

2.3.5 洗脱溶媒的选择

根据已确定的最佳动态吸附条件，吸取样液上柱。预吸附1h，然后用水洗除糖等杂质至Molish反应呈阴性，然后分别用蒸馏水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇各5BV上柱洗脱，流量控制为1.0 mL/min，蒸馏水每管收集50 mL，乙醇每管收集30 mL（即1BV），分别测定TsPJ水平，并绘制洗脱曲线如图2。

从图中洗脱曲线所示可知，TsPJ主要集中在50%和70%的乙醇洗脱液中，占全部乙醇洗脱液中总皂苷的80.61%，继续加入95%乙醇进行洗脱，洗脱液总皂苷量无明显变化。此外，综合考虑生产成本、洗脱效率即真空浓缩工艺等，选择70%乙醇为洗脱溶媒更为合适。故在洗脱过程中，先用蒸馏水洗去水溶性杂质，再用70%乙醇对TsPJ进行洗脱。

图2 D101大孔树脂洗脱曲线Fig.2 The elution curve of D101 macroporous resin

2.3.6 洗脱溶媒用量的考察

根据以上实验选定的吸附条件和洗脱溶媒，上样吸附后进行洗脱。蒸馏水用量分别选择5BV（条件 l）、4BV（条件2）、3BV（条件 3），洗脱溶媒 5BV，依次洗脱，并将体积流量控制在1.0 mL/min。分段收集洗脱液，测定其总皂苷。前3BV乙醇洗脱液水浴挥干并置于烘箱恒质量，计算总固物质量和总皂苷，结果见表5。

表5 D101大孔树脂不同条件洗脱参数考察Tab.5 The elution paraments of D101 macroporous resin on the differente conditions

3 种洗脱条件所得总固物量接近，且总皂苷量均在80%左右，从成本和节能考虑选择3BV蒸馏水洗去杂质。用70%乙醇洗脱TsPJ时，前3BV洗脱率将近90%，而后2BV洗脱率不到6%，并且各不同条件下洗脱所得总固物和总皂苷无明显差异，故选择3BV 70%乙醇为洗脱溶媒。

2.3.7 正交实验优选大孔吸附树脂纯化工艺参数

以单因素实验的结果为参考，选取影响效果较大的径高比、洗脱流量、洗脱溶剂用量进行L9（34）正交实验，并采用TsPJ转移率和纯度为指标进行综合评分，优选纯化条件。实验水平表及分析结果分别见表6、表7和表8。

表6 正交实验因素水平Tab.6 Factors and levels orthogonal test

由表7的极差可知，各因素对TsPJ转移率影响大小顺序为C（洗脱溶剂用量）＞A（径高比）＞B（体积流量）。表8的方差分析表明，径高比、流量均对TsPJ的纯化过程具有显著影响，洗脱溶剂用量具有极显著影响。从实验结果来看，大孔吸附树脂纯化TsPJ的最佳工艺条件为A3B2C1，即：径高比为1 ∶10，体积流量为 1.0 mL/min，洗脱溶剂用量为3BV。

2.3.8 工艺重复验证实验

为考察TsPJ的纯化率和精制度，根据单因素和正交实验结果，按最佳吸附和洗脱条件进行验证，平行3份，结果见表9。由表9可知，纯化后TsPJ占总固物的82.53%，精制度达到338.81%，转移率达到88.02%。表明用D101大孔吸附树脂纯化TsPJ的工艺较为稳定可靠，且纯化效果较好。

表7 L9（34）正交实验设计方案及结果 （n=3）Tab.7 L9（34）orthogonal test and results

表8 方差分析Tab.8 Variance analysis

2.3.9 树脂重复使用周期的考察

取新的D101大孔吸附树脂柱3根，根据已确定的最佳吸附及洗脱条件，在同一根树脂柱上反复进行吸附和洗脱实验，结果见表10。

表9 工艺参数验证实验结果Tab.9 The experiment of technique validation

表10 D101大孔吸附树脂的重复使用周期考察 （n=3）Tab.10 The review of reusing cycles D101 macroporousresin（n=3）

结果表明，新的D101型大孔吸附树脂的比吸附量与用过1次、2次、3次后的比吸附量差别不大，但是树脂重复使用4次后，吸附性能较之新树脂有所下降，可能与其上样时容易出现结板和气泡有关。实验中，新树脂使用后颜色变深，用95%的乙醇浸泡24h以上，用乙醇和蒸馏水反复洗脱后颜色会变浅，说明其再生利用的效果较好。

3 讨论

皂苷是一类相对分子质量较大、极性较大的苷类化合物，药材中共存的鞣质及糖类等成分的影响使得皂苷类成分难以分离提纯。大孔树脂作为一类新型非离子型高分子化合物，近年来已广泛应用于天然药物有效部位的分离与纯化。D101、HPD100、LX-68及AB-8均为球形非极性或弱极性聚合物多孔吸附剂，对皂苷类成分有特殊的选择性，适合从水溶液中提取皂苷类成分；而S-8虽然是苯乙烯型极性共聚体，也作为考察指标之一进行综合评价。实验结果标明，相比于其它类型大孔吸附树脂，D101树脂对TsPJ有着相对较高静态吸附量和静态解析率。

而到目前为止，我国仍然没有一套由权威机构制订的使用考察方案，各个使用单位在树脂考察方面也是不尽相同。本实验根据大孔树脂的吸附、洗脱两个特点，以提取液上样浓度、上样液pH值、上样量、上样体积流量、洗脱体积流量、洗脱溶剂选择及用量等为主要考察项目，逐一进行单因素考察，然后再参照单因素考察结果，将未列入单因素考察项目的树脂柱径高比和单因素实验中影响较大的体积流量、洗脱溶剂用量进行正交实验设计，最后将考察结果列入树脂纯化工艺参数，比较全面地制订了一套比较实用的树脂工艺考察方案。并确立了D101型大孔树脂分离TsPJ的纯化工艺：上样浓度0.2 g生药/mL，pH值6，径高比为1∶10，以3BV 70%乙醇溶液洗脱，吸附及洗脱体积流量均为1 mL/min。研究结果表明，未纯化前总固物中总皂苷的质量分数为24.36%，纯化后总固物中的TsPJ质量分数为82.53%，精制度达338.81%，且转移率达 88.02%。从精制度、转移率等方面考虑，该工艺适宜于TsPJ的分离及纯化。

层析柱的粗细会影响分离效果，当柱子太细，洗脱时，树脂易结块，壁上易产生气泡，体积流量会逐渐降为零，因此不能选择过细的柱子，避免造成较大误差。而较小的树脂粒径和较低的树脂高度有利于增大吸附速度，但同时也使单柱的吸附量有所降低，所以树脂柱最佳径高比一般选择在1∶7～1∶10范围内。

吸附过程为一放热过程，故还应考虑上样液的温度，有文献报道，低温有利于提高中药成分的比上柱量［10］，建议在上样前将样品液冷藏处理。提取液在上柱前，必须进行抽滤或离心等预处理以除去沉淀和杂质，上样液越澄清，所得产物的纯度越高，亦能提高树脂的使用寿命，通过预实验考察可知用活性碳进行脱色处理后的样品液通过树脂柱后所得产物纯度较未进行脱色处理时高，而且树脂再生更为容易。

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Separation and purification of total saponin from Panacis japonici Rhizoma by macroporous resins

OUYANG Li-na， WU Xue， LI Lan-lin， SUN Xiao-bo， XIANG Da-xiong*
（1.The Second Xiangya Hospital of Central Sounth University，Changsha 410011，China；2.The First People Hospital of Yueyang City，Yueyang 414000，China；3.Beijing Jishuitan Hospital，Beijing 100035，China）

Panacis Japonici Rhizoma；total saponin；macroporous resins；purification

R284.2

A

1001-1528（2011）07-1163-06

2010-09-17

湖南省中医药科研计划项目（2009062）

欧阳丽娜（1984—），女，主要从事药物新资源及新课型的开发。Tel：（0731）5292093，E-mail：ouyanglina410@126.com

* 通信作者：向大雄，Tel：（0731）5292093，E-mail：xiangdaxiong@163.com