显微镜检测用蔗糖和蔗糖产品掺假的蜂蜜

黄文诚 译自Apidologie（1995）26,131-139

蜂蜜掺假是尽人皆知的问题，已有许多分析方法检测用各种糖和廉价糖浆伪造的蜂蜜。在某些热带国家，当地市场出售的蜂蜜可能直接添加蔗糖、蔗糖浆、加热酸水解蔗糖得到的蔗糖浆或者给蜜蜂喂糖获得的“蜜”。通过常规的化学分析，诸如果糖、葡萄糖、蔗糖、羟甲基糠醛含量及淀粉酶值，这样蜂蜜的掺假容易被检测出。

然而，在许多发展中国家，不一定有上述常规分析实验室，借助简单的显微镜分析可能检测用蔗糖及蔗糖产品的掺假蜂蜜。蔗糖有内在来源的指示物。它含有来源于甘蔗茎的许多有特性的颗粒：薄壁细胞、硬化细胞、表皮细胞、环形导管的单环及甘蔗淀粉。这些颗粒存在于原糖、精制白糖和红糖（B型）以及糖蜜，但是不含在甜菜糖、槭糖和印度尼西亚棕榈糖中。

文献中没有介绍过蜂蜜中蔗糖颗粒显微镜分析的具体方法。有些研究人员提到蜂蜜沉淀中除花粉以外还存在其他结构的颗粒，但是没有给出植物细胞的详细识别方法。

在蔗糖及蔗糖产品用于掺假的事例中，如同经典的花粉分析，离心1∶2蜂蜜水溶液，得到的残渣中除了花粉、甘露成分和草酸结晶以外，含有表示特性的甘蔗植物细胞。将水洗的残渣安装在甘油浆中以后，进行显微镜分析。采用交叉偏振和1级红色阻滞片，蔗糖的存在立刻显示出蔗糖细胞的明亮的图像。图1～7是典型的形式。乙酸水解法是孢粉分析的程序，花粉沉淀通过无水乙酸或硫酸的乙酸水解以获得清晰的花粉细胞壁，此法不能用于检查这些植物细胞，因为在乙酸水解过程中这些细胞被破坏了。

图1 蜂蜜中蔗糖的硬化细胞，正常光，750×

图2 蜂蜜中蔗糖的硬化细胞，交叉棱镜，750×

图3 蜂蜜中蔗糖的薄壁细胞，交叉棱镜，750×

图4 蜂蜜中蔗糖的单环，正常光，750×

图5 蜂蜜中蔗糖的单环，交叉棱镜，750×

图6 蜂蜜中蔗糖的表皮细胞，正常光，750×

图7 蜂蜜中蔗糖的表皮细胞，交叉棱镜，750×

偏光显微镜对于这种分析尤其有用，因为交叉棱镜在黑色背景下具有由许多纤维素组成的细胞壁的植物细胞显示1级白干扰色；许多晶体和固有的淀粉颗粒也可看出。然而，花粉、酵母和真菌孢子光学上是不活跃的，在交叉棱镜下不能被看出。插入1级红色阻滞片，黑色背景变成酒红色，花粉、酵母和真菌孢子能被辨别，但是不被照亮。然而，取决于它们在显微镜视野的方向，光学活性的植物细胞（和晶体及固有的淀粉）显示2级亮蓝色（红色I加白色I）或1级黄干扰色（红色I减白色I）。

本研究中，对蔗糖组织的显微镜分析结果与蜂蜜中葡萄糖、果糖和蔗糖含量以及羟甲基糠醛值进行了比较。在某些热带（亚热带）国家，蜜蜂从切割的或燃烧的甘蔗茎采集渗出液。因此，在这项研究中也包括一些蔗糖蜜的显微镜分析。

1 材料和方法

1.1 样本

蜂蜜样本是1987年进行调查时从菲律宾得到的。两个高度怀疑的样本是从地方市场购买的，在荷兰食品检验局分析。另外8个蜂蜜样本来自尼泊尔加德满都，它们是在BETRESP实验室进行化学和显微镜分析时遇到的。通过对300多个蜂蜜样本的分析，BETRESP为尼泊尔建立蜂蜜国家标准奠定了基础。由于一些样本含有植物组织，也在荷兰阿姆斯特丹食品健康保护检验局实验室分析它们。

蔗糖样本是在尼泊尔加德满都商店购买的。纯蔗糖蜜是从荷兰阿姆斯特丹食品检验局得到的。1个样本来自古巴，另一个来自马德拉（群岛）。

1.2 分析方法

显微镜分析是按照蜜源植物国际委员会发布的方法进行，在20 ml水中溶解10 g蜂蜜（或10 g蔗糖），离心，用水洗出沉淀，再次离心，取沉淀放入100 μl水中。为进行定量分析，取10 μl悬液放在载玻片的1cm2上，干燥，覆盖甘油胶。蔗糖颗粒用交叉偏振和1级红色阻滞片在400倍下计数。其余悬液放在另一载玻片，干燥，覆盖甘油胶。这个玻片用于定性鉴定，必要时用同样的显微镜技术进行低数量计数。

蔗糖的薄壁细胞近似长方形，有各种大小：细胞大部分长为50～100um,宽约40～60um。也有近圆形的。硬化细胞长方形，长约100～200um，宽40～50um。这两种细胞都有光学激活的细胞壁蓝色（北方或西南方向）和黄色（西北方或东南方向）的偏光色。薄壁细胞和硬化细胞的表面具有许多直径2～3um的小坑，每个小坑有1个偏振交叉或具光学激活的外界（黄色或蓝色）的单一射线（图1～3）。

因为它们有自己的小坑为特性，薄壁细胞和硬化细胞在定量工作中一起计数，表示为10 g蜂蜜中它们的总数。细胞的聚集部分在每次计数时作为1个细胞。环形导管的单环细胞也有特性。它们的直径约30～50um（图4）。在每个单环显示蓝色和黄色偏振光色；颜色被小的红色带（图5：黑色）交替改变。单环的计数表示为10g蜂蜜中的总数。

表皮细胞的特点是它们的起伏的长细胞壁；1个细胞的大小约15um×150um。长的细胞壁在东北或西南方向显示亮蓝的偏振光色。蓝色细胞壁之间是明亮的黄色。在另一方向（西北或东南）偏振光色相反（图6和7）。表皮细胞在蜂蜜残留中大部分聚集在一起。计数单个细胞和聚集细胞，表示为10g蜂蜜中的总数。

用高压液相色谱技术确定羟甲基糠醛；糖（葡萄糖、果糖和蔗糖含量）也用一种高压液相色谱方法测定。pH和电导率以20%蜂蜜（m/m）（或蔗糖溶于蒸馏水）测量。电导率在蜂蜜表示为uS/cm。水含量用折射计测量。

2 结果

来自菲律宾和尼泊尔的10个掺假蜂蜜样本化学的和显微镜的分析结果见表1和表2。表中也给出了1种结晶的正常质量的尼泊尔蔗糖以及2种低质量的蔗糖糖蜜细粉的分析结果。

蔗糖蜂蜜样本为暗棕色或黑色，有蔗糖的回味，其显微镜分析未观察到蔗糖植物细胞。在R128样本中的花粉粒总数具有正常值；大部分花粉来自棕榈（Palmeae species）。样本A485不含花粉，但是有大量的草酸钙结晶。

表1 蜂蜜和蔗糖样本的化学性质

3 讨论

3.1 蜂蜜样本

10个蜂蜜样本的化学数据证明它们全部或部分掺假了，或至少过度加热了。显微镜数据得出的结论是样本掺假了。蔗糖组织与蔗糖含量没有直接的相互关系，但是8个尼泊尔样本的确有大量的蔗糖组织和大量的羟甲基糠醛，它是用酸水解蔗糖浆掺假的指示。2个菲律宾蜂蜜不包括在内，实际上它们不含羟甲基糠醛（它们含有非常低的淀粉酶值，未插在表内），或许用蔗糖直接与蜂蜜混合掺假。

在某些蜂蜜样本中与蔗糖组织一道有许多小麦淀粉颗粒，可以指出它们用少量的蔗糖糖蜜掺假了。

表2 蜂蜜和蔗糖样本的显微镜特征

3.2 显微镜分析

采用偏光显微镜（交叉棱镜和1级红色阻滞片）使蔗糖组织的鉴定非常容易。使用偏光显微镜放大100倍就能鉴别薄壁细胞、硬化细胞、单环和表皮细胞。尤其，第一眼就能看到环。为了正确识别表皮细胞，特别是薄壁细胞和硬化细胞最好采用较大倍率（400倍），或者只用交叉棱镜，这样容易检查出薄壁细胞有特征的小坑。

这10个掺假蜂蜜样本的薄壁细胞和硬化细胞平均值及标准差和范围制成表3。

尼泊尔典型的白糖10g样本含有的薄壁细胞和硬化细胞数为5902。在以前的研究，发现来自不同国家的各种蔗糖，10g中含有单环76～595个；表皮细胞25～222个；薄壁细胞和硬化细胞的数值特别大，通常为3000～6000个。也发现蔗糖含有薄壁细胞、硬化细胞、表皮细胞和环。从这些观察表明，在鉴别蜂蜜样本的蔗糖组织时，似乎绝不可能得到假阴性的结果。

不可能有假阳性结果。从在尼泊尔BETRESP工程监督之下的养蜂人得到的蜂蜜样本，经显微镜分析没发现蔗糖组织；化学分析也显示正常值。

估计蜂蜜中存在蔗糖的检测限度为，样本显示在载玻片1cm2面积上，10g蜂蜜中最低约有30个薄壁细胞能容易被检查出来。从这些数据和计算蔗糖中薄壁细胞和硬化细胞数量的自然变量，由此得出的结论是，在样本中甚至含有1%或2%蔗糖用这种方法就能检查出来。

表3 10个掺假蜂蜜样本中薄壁细胞、硬化细胞、环合表皮细胞的平均值及标准差以及范围

4 结论

蜂蜜样本甘蔗组织的显微镜筛查，对检测甚至添加到蜂蜜里非常低的蔗糖、转化糖浆及喂蜜蜂蔗糖产的“蜜”是一种附加方法。本研究中描述的，当检查蔗糖蜜样本不含甘蔗植物细胞时，我们可以得出结论：甘蔗组织的存在表明蜂蜜样本掺假了。计算甘蔗组织，能得到蜂蜜样本中蔗糖数量的指示。这种方法容易应用在来自发展中国家的蜂蜜分析，用简单的设备可以做到。与羟甲基糠醛值相结合，显微镜方法可以区分加热和掺假。