缺血后适应对局灶性脑缺血/再灌注大鼠p38表达的影响*

武慧丽，赵永青，侯亚红，王雪莲

(1.武警医学院附属医院神经科，天津 300162;2.武警海南总队医院，海口 570100)

缺血后适应(ischemic postconditioning，IP)是Zhao ZQ等在研究缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)心肌的保护过程中发现并提出的，因此将其定义为在心肌长期缺血之后，再灌注开始时，经历的短暂、重复缺血再灌注，从而起到保护缺血心肌的现象[1]。IP作为缺氧耐受现象的一种，与缺血预适应一样可以明显减轻脑I/R损伤，明显缩小脑梗死的体积，减轻迟发性的神经元的凋亡，明显改善缺血后的神经功能[2]。近年研究表明，丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信号转导通路介导脑I/R损伤的细胞凋亡过程[3]，而p38是该信号转导通路中的关键成员之一，故本研究拟观察IP对大鼠脑I/R损伤后凋亡细胞数目、p38蛋白表达的影响，探讨IP对脑I/R损伤的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

p38单克隆抗体为Santa Cruz公司产品，辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠IgG购自鼎国生物制品公司，Western blot检测试剂盒，小鼠抗大鼠β-actin抗体、BCA试剂盒、原位末端标记(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)法细胞凋亡检测试验盒、DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 实验动物及分组

雄性SD大鼠30只，体质量250～300g，由武警医学院实验动物中心提供。动物随机分为3组(n=10):假手术组(sham组)、脑缺血/再灌注组(I/R组)和缺血后适应组(IP组)。

1.3 实验方法

用Longa法[4]制作大鼠局灶性脑I/R模型:大鼠称重，10%水合氯醛300mg/kg腹腔麻醉，暴露右颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，在颈外动脉距其始端约2 mm处做一小切口，将3-0号尼龙线一端烤成小球形经切口处插入颈外动脉，再经颈内动脉至大脑中动脉始端，栓塞大脑中动脉，造成局灶性脑缺血，大鼠脑缺血90min后，拔出尼龙线，恢复脑组织供血。Sham组大鼠在尼龙线小球端插入至大脑中动脉始端后，立即拔出。IP组在缺血90min后再灌注开始时将尼龙线拔出20s，再将尼龙线放进20s，按上述时间循环3次，再进行再灌注。

1.4 神经病学评分

手术后功能缺损按Longa 5分制标准进行评分:0分，无明显神经病学症状;1分，不能完全伸展左前肢;2分，向左侧旋转;3分，行走时向左侧倾倒;4分，不能自行行走，有意识障碍。累积1分以上即可判断模型成功建立。动物苏醒后，观察缺血动物的神经功能缺失症状。

1.5 脑组织取材

脑缺血/再灌注24h后，用10%水合氯醛(300mg/kg)对大鼠进行麻醉。每组5只大鼠用4%多聚甲醛灌注固定、断头取脑及后固定。切取额、顶叶脑组织，恒冷箱切片机冠状连续切片，片厚 10μm，用于凋亡细胞的检测。其余大鼠经10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，迅速断头取脑，于冰上分离缺血侧顶叶皮层脑组织，用冰生理盐水冲洗后，迅速置于液氮罐中低温保存用于Western blot。

1.6 TUNEL法检测凋亡细胞

冰冻切片按试剂盒说明进行操作。光镜下，脑组织切片中细胞呈棕色者为阳性细胞。高倍镜下随机选取每张切片梗死周边组织五个视野，分别计数TUNEL阳性细胞数和总细胞数，计算凋亡细胞百分率，取平均值。凋亡细胞百分率=TUNEL阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.7 Western blot检测脑组织p38蛋白表达

Western blot检测采用常规方法进行。等量蛋白样品经10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，以湿转法电转移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，用新鲜配制的含3%脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)封闭，然后加入 p38单克隆抗体(1∶1000)，4℃反应过夜。将膜取出，用PBS洗涤3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗37℃孵育 2 h，最后用化学发光法，X-线片记录结果。CHemiDOC XRS凝胶成像系统进行免疫印迹分析。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 缺血后适应对神经病学评分的影响

各I/R组大鼠术后出现明显的神经功能缺陷症状，大多表现为不同程度的左侧前肢屈曲、向左侧旋转，行走时向左侧倾倒。Sham组大鼠有3只出现左前肢轻度屈曲症状。IP组大鼠神经功能缺陷症状比I/R组明显减轻。各组评分相比较，差异有显著性(P＜0.01，表1)。

2.2 缺血后适应对神经细胞凋亡的影响

Sham组偶见凋亡细胞，I/R组缺血区可见较多凋亡细胞，细胞核着色深，主要见于梗死灶周围，与Sham组比较有显著差异(P＜0.01)。IP组凋亡细胞百分率明显减少，胞核颜色明显变浅，与I/R组比较差异显著(P＜0.01，表1)。

Tab.1 Effect of ischemic postconditioning on neurological deficit score and apoptosis(，n=10)

Tab.1 Effect of ischemic postconditioning on neurological deficit score and apoptosis(，n=10)

I/R:Ischemia/reperfusion;IP:Ischemic postconditioning**P＜0.01 vs sham group;##P＜0.01 vs I/R group

Group Neurological deficit score Apoptotic percentage(%)Sham 0.4±0.21 4.56±0.41 I/R 2.5±0.56** 39.52±2.27**IP 1.3±0.28## 18.69±1.53##

2.3 缺血后适应对大鼠脑组织p38蛋白表达的影响

内参β-actin在各组表达较为一致。p38蛋白表达在Sham组呈较低水平，p38/β-actin的灰度比值约为 0.09±0.02;局灶性脑缺血/再灌注后，p38蛋白表达明显升高，p38/β-actin的灰度比值约为0.95±0.17，与Sham组相比差异有显著性(P＜0.01);在IP组，p38蛋白表达明显降低，但仍高于Sham 组，p38/β-actin的灰度比值约为0.36±0.09，与 Sham 组及IR组相比，差异非常显著(P＜0.01，图1)。

Fig.1 Western blot for p38 in the brain

3 讨论

缺血后适应与缺血预适应均为机体对缺血性损伤的内源性保护机制，它们可以减轻再灌注损伤的多种触发因素如:氧化、促炎性细胞因子、中性粒细胞等，从而减少凋亡的发生，减轻缺血细胞的损伤，缩小梗死体积。p38是MAPK家族成员之一，它的激活介导了多条信号转导通路，并参与细胞生长、分化和凋亡等多种功能的调节。关于p38在脑缺血预适应中的作用，报道的结果并不一致。Nishimura等研究发现脑缺血预适应可通过诱导p38的激活来提高海马组织对缺血的耐受能力，而Lee[5]的研究结果却显示细胞凋亡的发生与p38激活有关。那么在脑I/R后实施的缺血后适应对神经细胞凋亡的影响及p38的变化尚未见报道。

本实验观察了Sham组，缺血/再灌注组和IP组神经细胞凋亡的变化及p38蛋白表达水平的变化。结果显示:大鼠脑缺血/再灌注后凋亡细胞细胞数量和p38蛋白表达水平均显著升高，而IP组凋亡细胞数量和p38蛋白表达水平均显著低于缺血/再灌注组。提示缺血后适应可能通过下调p38蛋白表达，部分阻断MAPK信号转导通路而减少细胞凋亡的发生，减轻脑缺血/再灌注损伤的程度，与Lee的研究结果一致。

由于后适应干预的时间是发生在缺血事件发生以后，这就为治疗缺血性脑血管病临床应用提供了可能性。缺血后适应的干预过程简单，对于脑梗死早期血管成形术或介入治疗血管再通过程中，后适应可能有助于减少再灌注损伤，从而提高再灌注治疗的疗效，具有良好的临床应用前景。

[1]Zhao Z Q，Corvera J S，Halkos M E，et al.Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion:comparison with ischemic preconditioning[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2003，285(2):H579-588.

[2]Xing B，Chen H，Zhang M，et al.Ischemic post-conditioning protects brain and reduces inflammation in a rat model of focal cerebral ischemia/reperfusion[J].JNeurochem，2008，105(5):1737-1745.

[3]王瑞敏，张全光，武 鹏，等.p38/caspase-3介导的MEF2C信号通路参与大鼠脑缺血再灌注损伤[J].基础医学与临床，2007，27(5):530-534.

[4]Danielisová V，Némethová M，Gottlieb M，et al.The changesin endogenous antioxidant enzyme activity after postconditioning[J].Cell Mol Neurobio，2006，26(7-8):1181-1191.

[5]Lee S R，Lo E H.Interactions betweenp38mitogen-activated protein kinase and caspase-3 in cerebral endothelial cell death after hypoxia-reoxygenation[J].Stroke，2003，34(11):2704-2709.