CXCR7-shRNA慢病毒表达载体对人结肠癌细胞生物学特性的影响

王红鲜，陶霖玉，齐 柯，向 红，张好云，冯 铎，孔 恒，林秋生，陈天文

(广东医学院附属南山医院，广东深圳 518052)

研究发现，CXCR7不仅能提高许多肿瘤细胞的生存和生长活力，还能增强其黏附和迁移能力。应用 CXCR7拮抗剂还可抑制实验动物体内肿瘤的生长和转移[1]，但 CXCR7对人结肠癌细胞生物活性的影响未见报道。本研究以人结肠癌 HT-29细胞系为研究对象，运用 CXCR7-shRNA慢病毒表达载体沉默 CXCR7基因的表达，观察其对 HT-29细胞的生长和迁移的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人结肠癌细胞 HT-29由中南大学湘雅医学院细胞中心提供，采用 RPMI 1640和 DMEM完全培养基(均含 10%小牛血清，100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)，置 5%CO2的 37℃饱和湿度的培养箱内培养。CXCR7-shRNA慢病毒表达载体根据人 CXCR7序列(GeneBank，NM_020311)设计 siRNA靶点序列，合成 shRNA引物序列[2];阴性无关对照序列的 shRNA重组质粒标准品由 Trono Lab提供。Rabbit anti-CXCR7多克隆抗体、Rabbit anti-GAPDH多克隆抗体及辣根过氧化酶(HRP)标记Goat anti-Rabbit IgG由 Abcam公司提供，RIPA蛋白裂解液(强)、PMSF蛋白酶抑制剂由碧云天生物技术有限公司提供，ECL化学发光试剂盒购自美国Upstate公司。

1.2 方法 ①实验分组:将人结肠癌细胞 HT-29分成 3组:实验组:转染慢病毒 CXCR7-shRNA表达载体;阴性对照组:转染慢病毒 shRNA阴性对照载体;空白对照组:不予任何处理。②细胞转染:转染前 24 h将生长状态良好的 HT-29细胞接种于 6孔细胞培养板中，当细胞密度为 60%～75%时，实验组和阴性对照组细胞中分别加入相应的病毒上清液(转染复数 =感染时病毒/细胞数量 =20)，收取转染效率在 80%以上的目的细胞。③HT-29细胞中CXCR7蛋白表达检测:采用 Western blot法，以 IODCXCR7/GAPDH计算 CXCR7蛋白的相对表达量。④HT-29细胞增殖能力检测:采用噻唑蓝(MTT)法，取值以各测试孔的 OD值减去本底 OD值为标准。⑤Transwell细胞迁移实验:在 Transwell下室的DMEM培养液中加入 NIH3T3上清作为迁移诱导因子，在 Transwell上室滴加 200μl 1×104HT-29细胞悬液。将上室置于下室之中，在 37℃温箱孵育。24 h后取出上室，经 PBS洗涤后，用 4%多聚甲醛固定迁移至上室外表面上的细胞，HE染色，计算迁移细胞数，结果取上、下、左、右、中 5个视野(400×)细胞计数的平均值。

1.3 统计学方法 采用 SPSS13.0统计软件，结果用±s表示，多组间比较用单因素方差分析，两组间比较用 S-N-K法。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HT-29细胞中 CXCR7蛋白表达水平 各组HT-29细胞中 CXCR7蛋白表达见图1，显示在以LV-CXCR7-shRNA转染的实验组 HT-29细胞中，CXCR7蛋白表达水平均低于阴性对照组和空白对照组(P均 ＜0.05)，而阴性对照组和空白对照组比较无统计学差异(P＞0.05)，提示慢病毒 CXCR7-shRNA表达载体能有效降低 HT-29细胞中 CXCR7蛋白的表达。

2.2 细胞增殖能力 各组 HT-29细胞分别于接种后第 1～5天每天以 MTT法检测细胞密度(OD值)，见表1，并根据检测的 OD值绘制细胞的生长曲线(图 2)。结果显示实验组生长曲线较平缓，细胞生长速度较阴性对照组和空白对照组显著降低(P均 ＜0.05);阴性对照组细胞生长曲线较空白对照组低平，提示靶向抑制 CXCR7表达有潜在抑制结肠癌细胞增殖的作用，同时慢病毒载体本身也可能存在细胞毒性。

表1 各组不同时间的细胞密度(OD值，±s)

表1 各组不同时间的细胞密度(OD值，±s)

组别 1 d 2 d 3 d 4 d 5 d实验组 0.436±0.010 0.861±0.043 1.159±0.117 1.612±0.120 1.790±0.112阴性对照组 0.554±0.016 1.090±0.074 1.682±0.085 2.022±0.112 2.120±0.125空白对照组 0.596±0.022 1.200±0.050 1.895±0.083 2.146±0.098 2.213±0.095

图1 各组CXCR7蛋白表达水平

图2 各组细胞不同时间生长曲线

2.3 Transwell细胞迁移实验 在 NIH3T3上清趋化作用下，迁移至下室的细胞数目在实验组、阴性对照组和空白对照组分别为(15.2±2.59)、(26.2±3.83)、(28.0±3.39)个/HP。与阴性对照组和空白对照组比较，实验组穿透滤过膜细胞数量明显减少，差异有统计学意义(P均 ＜0.05)。提示靶向沉默CXCR7的表达明显抑制人结肠癌细胞 HT-29的迁移运动。

3 讨论

肿瘤细胞的生物学特征与肿瘤细胞的恶性行为、转移能力和转移特征存在密切的关系，早期肠道肿瘤起源于正常黏膜组织，其上皮细胞异常增殖形成腺瘤，进而穿透黏膜肌层，侵及黏膜下层，发展为恶性肿瘤，大部分的结肠癌是由腺瘤癌变而来[3]，肿瘤细胞的异常增殖和迁移是结肠癌发生发展的关键步骤，其促进因子可以用来做为临床药物治疗的靶标。

趋化因子及其受体参与肿瘤的起源、增殖和恶化，尤其是趋化因子 CXCL12及其受体 CXCR4和CXCR7在这一进程中发挥重要作用[4]。CXCR7是2005年 Balabanian等[5]发现的归巢性趋化因子 CXCL12的高亲和受体，既往被命名为孤儿受体RDC1。Miao等[6]研究发现配体活化的 CXCR7能提高肿瘤细胞的生长、黏附和侵袭能力。Wang等[7]采用高密度组织芯片染色技术，观察到在高侵袭性的前列腺癌组织中 CXCR7表达上调;CXCR7的表达上调除了提高前列腺癌细胞株的存活优势外，还与增强细胞的黏附和侵袭性相关。进一步研究发现 CXCR7潜在的下游信号 CD44和钙黏蛋白-11，可能由此提高 PCA细胞侵袭能力。Burns等用一种特异高亲和力的小分子 CXCR7拮抗剂能抑制乳腺癌、肺癌的生长和转移。

本实验采用重组慢病毒 CXCR7-shRNA表达载体来特异性沉默 CXCR7基因的表达，Western blot检测结果显示 CXCR7蛋白的表达明显下调，表明抑制 CXCR7靶基因的表达成功。MTT及 Transwell细胞迁移实验的结果表明靶向沉默 CXCR7的表达能引起人结肠癌细胞 HT-29的增殖和迁移活力下降，提示 CXCR7可能通过促进肿瘤细胞的增殖和迁移作用参与结肠癌的生长和转移。

目前在结肠癌的治疗策略中，靶向药物的研究空前发展，表皮生长因子受体和 VEGF的单克隆抗体西妥昔单抗和贝伐单抗已经进入临床应用[8]，CXCR7与结肠癌的关系密切，具有促进结肠癌细胞生长和迁移的作用，有望成为结肠癌治疗新的分子标靶，其作用机制需要更深入的研究。

[1]Burns JM，Summers BC，Wang Y，etal.A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival，cell adhesion，and tumor development[J].J Exp Med，2006，203(9):2201-2213.

[2]王红鲜，陈道瑾，胡桂.shRNA慢病毒表达载体对人结肠癌细胞CXCR7表达的影响[J].中国普通外科杂志，2009，18(2):156-161.

[3]Tanaka T.Colorectal carcinogenesis:Review of human and experimental animal studies[J].J Carcinog，2009，8(2):5.

[4]Vandercappellen J，Van Damme J，Struyf S.The role of CXC chemokines and their receptors in cancer[J].Cancer Lett，2008，267(2):226-244.

[5]Balabanian K，Lagane B，Infantino S，et al.The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes[J].J Biol Chem，2005，280(42):35760-35766.

[6]Miao Z，Luker KE，Summers BC，et al.CXCR7(RDC1)promotes breast and lung tumor growth in vivo and is expressed on tumor-associated vasculature[J].PNAS，2007，104(40):15735-15740.

[7]Wang J，Shiozawa Y，Wang J，et al.The Role of CXCR7/RDC1 as a Chemokine Receptor for CXCL12/SDF-1 in Prostate Cancer[J].J Biol Chem，2008，283(7):4283-4294.

[8]Hegde SR，Sun W，Lynch JP.Systemic and targeted therapy for advanced colon cancer[J].Expert Rev Gastroenterol Hepatol，2008，2(1):135-149.