大鼠酒精性脂肪肝两种建模方法的比较

杨 芳，韩玉翠

(1安康学院农学与生命科学院，陕西安康 725000;安康市中心医院)

为探讨酒精性脂肪肝(AFL)的发病机制及病理过程，评判药物疗效，建立可重复、简单易行且稳定的 AFL动物模型十分重要。2009年 7～12月，我们通过比较两种大鼠酒精性脂肪肝模型，以探索稳定可靠的 AFL大鼠建模方法。

1 材料与方法

1.1 材料 SPF级雄性 SD大鼠 40只(180～200 g)，购自西安交大医学院实验动物中心。无水乙醇(国产分析纯)，丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒购于上海科华生物工程股份有限公司，γ-谷氨酰基转移酶(γ-GT)试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

1.2 方法 ①模型制备及动物分组:40只大鼠随机分为正常组(10只)、饮用乙醇组(10只)和乙醇灌胃组(20只)。正常组大鼠自由饮水;饮用乙醇组参照文献[1]报道:大鼠自由饮用乙醇饮料(每 100 ml水中溶解 15 g白糖)，其乙醇浓度从 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%，并且在 40%时，持续 4周;乙醇灌胃组参照文献[2]报道并加以改进，大鼠给予 40%乙醇灌胃，乙醇 8 g/(kg◦d)分 2次灌胃，2次间隔 9～10 h，灌胃至 6周末;自 7周开始，将乙醇浓度增至 50%，乙醇 9 g/(kg◦d)，同前分 2次灌胃，至 12周末。在实验过程中，3组大鼠均为自由采食，分笼饲养，每笼 4只，在室温及稳定湿度条件下，全价颗粒饲料(由动物中心提供)喂养，其持续时间为 12周。②标本处理:实验期间观察大鼠一般情况，心脏无菌采血，制备血清，立即用全自动生化分析仪检测 ALT、AST、γ-GT。肝脏称质量后作大体观察，计算肝指数(肝脏湿质量/大鼠体质量 ×100[3])。制作切切片、染色，光镜下观察肝脏组织形态及肝脏脂肪变性程度。含脂肪滴肝细胞所占面积评分标准如下:无脂肪变性为 0分;脂肪变性在肝小叶 ＜1/3为 1分;脂肪变性在肝小叶 1/3～1/2为 2分;脂肪变性在肝小叶 ＞1/2～2/3为 3分;脂肪变性在肝小叶 ＞2/3为 4分。

1.3 统计学方法 采用 SPSS13.0统计软件;计量资料以±s表示，多组间比较采用方差分析，多组间两两比较采用 SNK法;计数资料比较采用 χ2检验或确切概率法。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 12周末对照组、饮用乙醇组、乙醇灌胃组大鼠体质量分别为(506±48)、(420±33)、(415±31)g;饮用乙醇组、乙醇灌胃组大鼠体质量差异无统计学意义(P＞0.05)。饮用乙醇组大鼠发生胃肠胀气 3只，发生率为 30%;乙醇灌胃组发生胃肠胀气 17只，发生率为 85%;两组胃肠胀气发生率比较差异有统计学意义(P＜0.01)。

2.2 三组大鼠肝功能指标比较 12周后饮用乙醇组、乙醇灌胃组大鼠 AST、γ-GT水平、AST/ALT与对照组差异具有统计学意义(P均 ＜0.05)。12周后饮用乙醇组大鼠 ALT与对照组差异具有统计学意义(P＜0.05);乙醇灌胃组大鼠 ALT与对照组差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 三组大鼠 12周末肝功能检测结果(±s)

表1 三组大鼠 12周末肝功能检测结果(±s)

注:与对照组比较，*P＜0.05

正常对照组 10 47.43±3.69 91.29±7.27 1.45±0.67 1.92±0.04饮用乙醇组 10 77.71±10.06*188.57±33.65*4.76±0.88*2.42±0.24*乙醇灌胃组 20 51.00±5.48 197.00±35.98*5.13±0.90*3.84±0.35*

2.3 三组大鼠肝脏大体标本观察指标比较 12周后饮用乙醇组、乙醇灌胃组大鼠实验前后体质量差、肝质量与体质量差比率、肝指数与对照组差异具有统计学意义(P＜0.05或 ＜0.01)。见表2。

表2 三组大鼠大体标本观察指标比较(±s)

表2 三组大鼠大体标本观察指标比较(±s)

注:与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

正常对照组 10 245.14±31.71 11.40±0.89 0.05±0.008 2.51±0.29饮用乙醇组 10 175.73±36.92** 11.86±1.06 0.07±0.017*2.94±0.36*乙醇灌胃组 10 158.50±22.77** 12.25±0.92 0.07±0.011*2.96±0.32*

2.4 肝脏组织病理观察 光镜下，模型组肝细胞胞质中可见大小不等圆形脂滴空泡，伴有局部炎症和坏死。依脂变范围，三组大鼠 12周脂肪变程度积分分别为(0.00±0.000)、(2.33±0.817)、(2.33±0.516)分，饮用乙醇组、乙醇灌胃组大鼠肝脏脂肪变程度积分与对照组差异具有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨论

目前，AFL动物模型有在饮水中加入乙醇的模型、Liber-Decarli液体食料和液体食料加辅剂模型[4，5]、Tsukamato French大鼠模型[6，7]。国内学者应用最多是乙醇灌胃来建立酒精性肝病模型，他们在喂饲固体饲料的同时，每日给大鼠灌胃一定量的乙醇，但这种方法繁琐，易引起因插管灌胃相关的并发症，甚至造成实验动物死亡。饮水中加入乙醇是生理方式喂食乙醇的方法，符合人类正常的乙醇摄入途径。通过添加蔗糖克服了大鼠厌乙醇的缺点。本次实验 12周末饮用乙醇组大鼠禁食禁饮后死亡1只、死亡率为 10%，乙醇灌胃组大鼠死亡 9只、死亡率为 45%，12周后饮用乙醇组与乙醇灌胃组大鼠AST活性、γ-GT含量、肝指数与对照组差异具有统计学意义，且肝组织出现大量脂肪变性，伴有局部炎症和坏死;饮用乙醇组与乙醇灌胃组 ALT、AST、γ-GT、肝指数差异无统计学意义。说明乙醇对模型大鼠肝脏均造成一定程度的损伤。

本次实验中饮用乙醇组、乙醇灌胃组大鼠处死后解剖发现，两组大鼠不同程度的伴有胃肠胀气。胃肠胀气产生的可能原因是:①大鼠肝脏功能衰退，消化吸收障碍使食物被上段消化道内大量的细菌分解，产生大量气体。而胃肠运动和血液循环障碍造成气体在肠腔聚积，形成胃肠胀气。②大鼠灌胃操作容易导致消化道黏膜的损伤，细菌繁殖，同时由于单次灌胃操作不能保证每次每只大鼠使用一支灌胃针，不可避免反复使用灌胃器操作，导致大鼠之间交叉感染。近端小肠内大量的细菌繁殖是肝衰竭时腹胀、肠胀气、中毒性鼓肠的主要原因之一。胃肠功能不全反过来可影响肝损伤的修复，甚至加重肝脏的损伤过程。

本研究结果显示，两种大鼠乙醇肝建模效果一致。生理方式喂食乙醇建立大鼠 AFL模型与人类AFL发生发展整个过程相似，具有很强的模仿性，并且此造模方法简单易行，一般实验室均可以进行，更值得被推广。

[1]王晓红，曹琦，李俊，等.改良法大鼠酒精性脂肪肝模型的建立[J].安徽医科大学学报，2007，42(4):420-423.

[2]林红，吕森，张义侠，等.酒精性肝病大鼠模型的建立[J].世界华人消化杂志，2001，9(1):24-28.

[3]Feng ZQ，Shen ZX，Tan SY，et al.Imp rovement of induction method of actue alcoholic fatty livermodel in rats[J].World Chin J Digestol，2003，11(8):1189-1192.

[4]Lieber CS，De Carli LM.The feeding of ethanol inliquid diets[J].Alcohol Clin Exp Res，1986，10(5):550-553.

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[6]Tsukamoto H，Reidelberger RD，French SW，et al.Long-term cannulation model for blood sampling and intragastric infusion in the rat[J].Am J Physiol，1984，247(3Pt2):R595-R599.

[7]Tsukamoto H，Horne W，Kamimura S，et al.Experimental liver cirrhosis induced by alcohol and iron[J].J Clin Invest，1995，96(1):620-630.