HPLC法同时测定钙泊三醇/倍他米松软膏中2种主药的含量

施燕，陈丹霞，何志高（同济大学附属东方医院药学部，上海市 200120）

钙泊三醇/倍他米松软膏用于稳定性斑块状银屑病的局部治疗，主要含有钙泊三醇、二丙酸倍他米松（以下简称倍他米松）2种成分。钙泊三醇是维生素D3体内活性代谢产物骨化三醇的类似物[1]，其通过与角朊细胞内的核受体结合，可调节角朊细胞的增殖与分化，即抑制细胞增殖、促进细胞分化，并有直接抗炎作用。为有效控制该制剂质量，笔者建立了同时检测其中钙泊三醇与倍他米松含量的反相高效液相色谱法[2]，该法至今尚未见文献报道。

1 仪器与试药

1.1 仪器

2695-996高效液相色谱仪，包括高压泵、自动进样器、紫外检测器和色谱工作站（美国Waters公司）。

1.2 试药

钙泊三醇/倍他米松软膏（丹麦利奥制药公司，批号：27011042005，规格：每支1 g，含钙泊三醇50 μg、倍他米松0.5 mg）；钙泊三醇对照品（台湾Formosa公司，批号：0835274，纯度：99.2%）；倍他米松对照品（中国药品生物制品检定所，批号：CRS100705A，按干燥品计纯度：99.4%）；水为去离子水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Intersil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-乙腈-磷酸盐缓冲液（0.01 mol·L－1磷酸氢二铵溶液，用磷酸调pH至6.0）＝58∶22∶20；流速：1.0 mL·min－1；柱温：25 ℃；检测波长：265 nm；进样量：100µL。

2.2 对照品溶液的制备

2.2.1 贮备液A：取适量钙泊三醇对照品，精密称定，用流动相溶解并定量稀释制成浓度为0.5 mg·mL－1的溶液，即得。

2.2.2 贮备液B：取适量倍他米松对照品，精密称定，用流动相溶解并定量稀释制成浓度为1 mg·mL－1的溶液，即得。

2.2.3 贮备液C：精密量取1.0 mL贮备液A，置于20 mL棕色容量瓶中，然后精密加入5.0 mL贮备液B，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.4 对照品溶液：精密量取5.0 mL贮备液C，置于50 mL棕色容量瓶中，然后加流动相稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm的微孔滤膜过滤，取续滤液作为对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

精密称定钙泊三醇/倍他米松软膏约1 g，置于25 mL棕色容量瓶内，用移液管精密加入20 mL的流动相，密塞，于50℃水浴5 min，取出剧烈振摇10 min，放置至室温，取上清液经0.45µm的微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.4 空白辅料溶液的制备

精密称定空白辅料软膏约1 g（按照本品的处方工艺进行制备，但不添加上述2个主要成分），置于25 mL棕色容量瓶内，用移液管精密加入20 mL的流动相，密塞，于50℃水浴5 min，取出剧烈振摇10 min，放置至室温，取上清液经0.45µm微孔滤膜滤过，取续滤液作为空白辅料溶液。

2.5 专属性试验

根据上述色谱条件，分别进样分析空白辅料溶液、供试品溶液、对照品溶液和溶剂（流动相），记录色谱，见图1。

图1 高效液相色谱图A.溶剂；B.对照品溶液；C.空白辅料溶液；D.供试品溶液；1.倍他米松；2.钙泊三醇Fig 1 HPLC chromatogramsA.solvent；B.reference solution；C.blank excipient；D.sample solution；1.betamethasone；2.calcipotriol

图1结果表明，钙泊三醇、倍他米松所对应的色谱峰分离度良好，且辅料对2个主要成分的测定均无干扰，说明方法的专属性强。倍他米松峰理论板数为2488，钙泊三醇峰理论板数为2820；图1中保留时间在5 min前的均为辅料峰。

2.6 线性关系考察

分别精密称取12.5 mg钙泊三醇、125 mg倍他米松对照品，置于100 mL棕色容量瓶中，加适量流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。

分别精密量取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL贮备液，置于100 mL棕色容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。精密吸取上述各溶液，注入液相色谱仪，记录色谱峰面积。分别以各主要成分的色谱峰面积（A）对溶液中各主要成分的浓度（c）进行线性回归，得到各回归方程详见表1。

表1 线性回归方程Tab 1 Linear regression equation

表1结果表明，钙泊三醇和倍他米松检测浓度线性范围分别为1.25～3.75、12.5～37.5 µg·mL－1。

2.7 重复性试验

精密量取供试品6份，按含量测定方法稀释，测定。结果，钙泊三醇、倍他米松的平均含量分别为101.2%和100.8%，RSD分别为0.84%和0.77%。

2.8 加样回收率试验

按75%、100%和125%3个不同浓度分别在空白辅料溶液中添加已知量的钙泊三醇、倍他米松对照品，混匀，测定并计算。结果，2种成分的平均加样回收率分别为100.4%和100.8%，RSD分别为0.75%和0.63%，详见表2、表3。

2.9 样品含量测定

精密称定钙泊三醇/倍他米松软膏约1 g，置于25 mL棕色容量瓶内，用移液管精密加入20 mL的流动相，密塞，于50℃水浴5 min，取出剧烈振摇10 min，放置至室温，取上清液经0.45µm的微孔滤膜滤过，取续滤液作为样品溶液。精密吸取样品溶液100µL，注入液相色谱仪进行分析，记录峰面积，并与对照品峰面积比较，按外标法计算样品中的主药含量。结果，3批样品中钙泊三醇标示含量分别为99.5%、98.5%、99.3%，平均含量为99.1%，RSD＝0.53%；倍他米松标示含量分别为99.2%、98.6%、98.8%，平均含量为98.9%，RSD＝0.31%。

表2 钙泊三醇回收率试验结果（n＝9）Tab 2 Result of recovery tests of calcipotriol（n＝9）

表3 倍他米松回收率试验结果（n＝9）Tab 3 Result of recovery tests of betamethasone（n＝9）

3 讨论

考虑到有文献[3]报道钙泊三醇对光、热比较敏感，在溶液中较容易转化为可逆的异构体，且与时间和温度有关。故本方法中明确了供试品溶液与对照品溶液应在临用前制备，且整个分析过程应快速并注意避光操作的要求。

经方法学验证，所建立的同时测定钙泊三醇/倍他米松软膏中钙泊三醇和倍他米松的含量的方法灵敏、精密度高、回收率好，可用于该制剂的含量测定。

[1]Marty JP，Lafforgue C，Grossiord JL，et al.Rheological properties of three different vitamin D ointments and their clinical perception by patients with mild to moderate psoriasis[J].Digest of the World Core Medical Journals，2006，2（5）：12.

[2]国家药典委员会编.中华人民共和国药典（二部）[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：附录ⅤD.

[3]俞银芳，刘兆鹏.活性维生素D3类药物研究概况[J].中国药物化学杂志，2006，16（5）：311.