氯霉素眼用温敏原位凝胶的制备及其兔眼刺激性研究

郝吉福，李学桐，张翠玲，王建筑，郭丰广，李菲（.泰山医学院药学院，泰安市 7000；.山东泰安荣军医院，泰安市 7000）

局部给药被认为是眼部给药系统的首选途径，临床常见眼用制剂包括滴眼剂、眼膏剂、凝胶剂等，但眼用液体制剂存在眼部滞留时间短、半固体制剂给药剂量不准确等缺点，为此，人们设计了基于高分子亲水聚合物为基质的原位凝胶系统用于眼部黏膜给药以期改善现存问题[1]。

氯霉素用于治疗由大肠杆菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌和其他敏感菌所致眼部感染，如沙眼、结膜炎、角膜炎、眼睑缘炎等，滴眼剂为其临床常用制剂。本文拟以氯霉素为模型药物，将其设计成眼用温敏原位凝胶，采用高效液相色谱（HPLC）法建立氯霉素含量测定方法，考察其体外药物释放特性及进行刺激性实验，为眼部药物传递提供新的给药系统。

1 仪器与材料

1.1 仪器

HPLC仪，包括LC-10AD泵、SPD-10A检测器、7225进样器、C-R6A数据处理器（日本岛津公司）；SHZ-88往复式水浴恒温振荡器（江苏太仓市实验设备厂）；KQ-500E型医用超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

氯霉素原料药（南京白敬宇制药有限公司，批号：090721，含量：99.37%）；氯霉素标准品（中国药品生物制品检定所，批号：130555-200803，含量：99.5%）；泊洛沙姆407、泊洛沙姆188（上海协泰化工有限公司）；氯霉素滴眼液（山东鲁抗辰欣制药有限公司，批号：091205，规格：12.5 mg∶5 mL）；氯霉素眼用温敏原位凝胶（泰山医学院药学院药剂实验室，批号：100323、100325、060326，规格：25 mg∶10 mL）；甲醇为色谱纯，氯化钠、苯扎溴铵均为药用级，水为注射用水。

1.3 动物

家兔，2.0～2.6 kg，♀♂各半，由山东鲁抗医药股份有限公司实验动物中心提供，合格证号：SCXK（鲁）20080002。

2 方法与结果

2.1 氯霉素眼用温敏原位凝胶的制备

参考临床所用氯霉素滴眼剂的规格为0.25%（g·mL－1），拟制备氯霉素眼用温敏原位凝胶的含量与之相同。取0.25 g氯霉素、0.9 g氯化钠先溶于注射用水中，加入25 g泊洛沙姆407、4.19 g泊洛沙姆188，低温（＜4℃）贮存24 h至泊洛沙姆完全溶解后，滴加5%的苯扎溴铵使其浓度为0.01%，加注射用水稀释制成2.5 mg·mL－1的氯霉素眼用温敏原位凝胶100 mL。

所制备凝胶为透明黏稠状液体，pH为7.02，采用搅拌子法测定胶凝温度为29.5℃，模拟泪液（每升模拟泪液（STF）包括：6.7 g氯化钠、0.08 g二水氯化钙和2 g碳酸氢钠，用硼酸调节其pH约为7.4）稀释后胶凝温度为34.4℃。对温敏原位凝胶的要求应在室温下为自由流动液体，体温条件下转变为半固态凝胶，因而胶凝温度是处方研究的主要内容（关于处方筛选过程已另文发表）。本试验所制备的温敏原位凝胶符合眼部用药的特点。

2.2 氯霉素含量测定

2.2.1 色谱条件。色谱柱：DiamonsilTMC18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水＝45 ∶55；检测波长：275 nm；柱温：25 ℃；流速：1.0 mL·min－1；进样量：20 μL。取“2.2.3”项下3种溶液进样分析，结果凝胶基质对氯霉素测定无干扰，理论板数按氯霉素计大于3000，在此色谱条件下氯霉素的保留时间为7.1 min左右，色谱详见图1。

图1 高效液相色谱图A.空白凝胶；B.标准品；C.样品；1.氯霉素Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank gel；B.standard；C.sample；1.chloramphenicol

2.2.2 标准曲线的制备。精密称取氯霉素标准品10.0 mg，置于25 mL容量瓶中，用适量甲醇溶解后，再用模拟人工泪液稀释定容，得400 mg·L－1贮备液，分别用流动相稀释成质量浓度分别为3.2、6.4、8、16、32 mg·L－1的系列标准溶液，进样20 μL。采用外标法，以氯霉素色谱峰面积（A）为纵坐标，氯霉素的浓度（c）为横坐标，进行线性回归，得标准曲线方程A＝42832c+3234.7（r＝0.9999）。表明氯霉素检测浓度线性范围为3.2～32 mg·L－1。

2.2.3 溶液的制备。标准品贮备液的制备：精密称取氯霉素标准品10 mg，用甲醇溶解定容到25 mL，稀释成0.4 mg·mL－1的溶液即为标准品贮备液。供试品溶液的制备：精密量取氯霉素眼用温敏原位凝胶0.1 mL，加3.9 mL流动相后离心（50000 r·min－1）15 min，取上清液2 mL置于10 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度。空白溶液的制备：取制备凝胶的各种辅料，按比例制成空白眼用温敏原位凝胶；按供试品溶液的制备方法制备成不含主药的溶液，即得。

2.2.4 精密度和回收率试验。在线性范围内制备低、中、高浓度的标准品溶液，于同日内连续进样5次及连续测定5 d，计算得日内RSD分别为0.36%、0.35%、0.57%，日间RSD分别为1.12%、0.51%、1.06%。精密量取已知含量样品（批号：100325）适量，共3份，分别加入80%、100%、120%标准品溶液，按“2.2.3”项下供试品溶液的制备方法制成溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进样，测定含量，结果回收率分别为97.87%、98.94%、100.75%，RSD分别为0.72%、0.54%、1.64%。表明该方法专属性强，灵敏度、准确性和重复性好，结果可靠，适用于氯霉素含量测定。

2.3 凝胶溶蚀与体外药物释放行为考察

2.3.1 凝胶的溶蚀与体外释药行为考察。采用无膜溶出法[2，3]考察凝胶溶蚀特征。取氯霉素温敏原位凝胶（约1～2 g）置于10 mL具塞刻度试管（15 mm×100 mm，已称重）中，精密称重，在（34±0.5）℃恒温水浴振荡器中放置10 min，待样品形成凝胶，加入2.4 mL释放介质（模拟泪液，34℃），恒温振荡，频率100 r·min－1，振幅20 mm。每20 min 取出全部释放介质，擦干试管表面，迅速称重，再将该试管放入恒温水浴振荡器中，平衡10 min，补充同温同体积新鲜释放介质，重复操作。相邻时间点的质量差为凝胶溶蚀量，以凝胶溶蚀量除以最初凝胶质量得不同时间点的凝胶累积溶蚀量，记为Q凝胶。

于考察凝胶溶蚀行为的同时测定药物的释放，将溶蚀试验得到的每次取出的溶液置于5 mL容量瓶中，放冷，以释放介质稀释至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，测定氯霉素的含量，以累积药物释放量Q药物与时间作图，得到药物释放曲线，详见图2。

图2 氯霉素眼用温敏原位凝胶溶蚀曲线Fig 2 Erosion curves of Chloramphenicol thermosensitive in-situ gel for ophthalmic use

2.3.2 凝胶的溶蚀与体外释药行为评价。采用数学处理方法对不同时间t与Q凝胶及Q药物进行方程拟合，探讨凝胶的释药机制。结果，凝胶溶蚀遵循零级动力学方程，其溶蚀曲线方程为：Q凝胶＝0.3104t－0.0177（r＝0.9952）；氯霉素体外Q药物与时间t不同拟合方程见表1（表中UQ为Unrelease quantity，即未释放药物量）。

表1 药物释放拟合方程Tab 1 Fitted equation of drug release

从表1中可知，氯霉素体外释药符合Hixon-Crowell模型，即溶出量的立方根与时间成正比，采用peppas方程对其释药机制进行探讨，lgQ＝0.785lgt+1.5033。从peppas方程的释放系数n（0.45＜n＝0.785＜0.95），可知药物从凝胶中的释放为非Ficks扩散，受药物扩散与凝胶溶蚀的双重机制的影响。另将Q凝胶与Q药物进行回归分析，得Q药物＝78.754Q凝胶+8.7019（r＝0.9969），表明凝胶溶蚀与药物释放呈良好的线性关系。

2.4 眼部刺激性实验[4，5]

为考察氯霉素眼用温敏原位凝胶连续给药对眼睛刺激情况，以家兔为对象，给药前先观察并记录每只家兔角膜、虹膜及结膜情况，已有病变或炎症者，剔除不用。取合格家兔6只，采用“同体自身对照法”进行实验。实验时，将家兔下眼睑轻轻提起，将结膜囊拉成环状，在家兔左眼结膜囊内滴入凝胶0.1 mL，同时在家兔右眼滴入0.1 mL氯霉素滴眼液作为对照，每天给药2次，连续7 d。给药后使家兔眼睛被动闭合8～10 s，观察每次给药前、后眼部情况及停药后连续7 d眼的局部反应情况（6、24、48、72、96、120、144、168 h，8～14 d），按Draize试验评分标准对角膜、虹膜及结膜分别进行评价，算出平均分值，并与同一家兔对照眼进行比较。然后按表2的评价标准，判断凝胶对眼的刺激性。当角膜、虹膜及结膜的刺激强度不一致时，应分别作出评价。眼刺激性评价标准见表2。

表2 眼刺激性评价标准Tab 2 Standard evaluation of eye irritation

计算各组不同时间的角膜、虹膜及结膜的平均分值，将3种平均分值相加，即得眼刺激反应的综合平均分值。根据评定标准判定制剂对兔眼的刺激性，结果见表3。

表3 氯霉素眼用温敏原位凝胶连续给药对家兔眼刺激性实验结果（n＝6）Tab 3 Results of eye irritation test by successive administration of Chloramphenicol thermosensitive in-situ gel for ophthalmic use（n＝6）

在观察期内发现，凝胶给药后角膜在实验初期有混浊现象，实验中后期混浊消失；虹膜无异常现象；结膜无水肿、无分泌物，在实验初期有轻微充血现象，实验中后期该异常现象消失。可能与实验过程中氯霉素温敏凝胶从冰箱中取出后直接用于实验，较低温度造成对家兔眼睛的刺激性有关。但经过一段时间能恢复正常，眼角膜、虹膜、结膜刺激综合评分小于3，表明氯霉素眼用温敏凝胶连续给药对兔眼无刺激性。

3 讨论

原位凝胶[6]（In-situ gel）是指以溶液状态给药后立即在用药部位发生相转变，形成的非化学交联的半固体制剂。形成机制利用了高分子材料对外界环境的响应，使聚合物在生理条件下发生分散状态或构象的可逆变化，实现由溶液向凝胶的转化过程。原位凝胶独特的溶液-凝胶转变性质使其具有制备简单、使用方便、与用药部位尤其是黏膜组织亲和力强、滞留时间长等优点。因此，原位凝胶能以液体状态自由加载各种性质的药物，是眼用制剂的优良载体[7]。

原位凝胶给药后在用药部位对外界刺激发生响应形成凝胶状，药物在眼部被相对固定，局部吸收较多，可防止某些极苦或强刺激性的药物不会大量快速通过鼻泪管流入口鼻，增加患者依从性。其在一定程度上还减少了滴眼剂的用量，减少了不良反应的发生，因此眼用温敏原位凝胶适合眼部给药。

国外研究[8]表明，泊洛沙姆对组织无明显损伤，刺激性小，生物相容性好，是常用的温度敏感性材料，其中泊洛沙姆188还是目前使用在静脉乳剂中唯一的合成乳化剂，因此安全性好。

研究凝胶类药物传递系统的释放行为，通常可采用扩散池法或透析法。笔者曾经采用家兔离体角膜渗透实验进行凝胶体外释放行为研究，但因为角膜上部给药时温度不宜控制，在实验过程中凝胶有时不发生相变，给实验结果带来较大误差。而后采用无膜溶出模型可更好地模拟眼内泪液不断分泌溶蚀凝胶的情况，且对于不同浓度凝胶的考察其前提是应保持一定的振荡频率，以保证凝胶溶蚀面积的恒定。在以后工作中尚需进一步考察眼用温敏原位凝胶的生物利用度。

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[4]赵宁民，张 凯，王豫辉.盐酸司帕沙星原位胶化滴眼剂的制备及质量控制[J].中国药房，2008，19（10）：772.

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[6]魏 刚，徐 晖，郑俊民.原位凝胶的形成机制及在药物控制释放领域的应用[J].中国药学杂志，2003，38（8）：564.

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