雷公藤多苷对大鼠卵泡发育及其旁分泌调控机制的影响Δ

杨涓，高慧，韩冰，董江川（1.重庆医科大学附属第一医院，重庆市 400016；.承德医学院附属医院，承德市 067000；.天津中医药大学第二附属医院，天津市 00150；4.重庆医科大学中医药学院，重庆市 4011）

雷公藤多苷（GTW）是临床应用最广泛的雷公藤制剂，具有免疫调节、抗炎、抗肿瘤等药理作用。部分自身免疫性疾病女性患者服药后发生月经紊乱和闭经，故成为卵巢早衰的医源性因素之一[1]。既往研究表明，GTW对生殖功能具有抑制作用，表现为月经周期延长、闭经、血浆雌二醇（E2）水平下降，卵泡雌激素（FSH）升高，故认为其作用靶点在卵巢[2]，而对其生殖毒理的研究则以细胞凋亡为主要研究方向[3]，未见雷公藤对卵泡发育调控因子影响的研究报道。本课题组通过对大鼠卵巢结构观察及各级卵泡计数比较研究GTW对各发育阶段卵泡的影响，并通过对旁分泌调控因子卵泡刺激素特异受体（FSHR）、表皮生长因子（EGF）和缝隙连接蛋白 43（Cx43）mRNA的表达观察GTW对卵泡发育调控机制的影响，探讨其生殖毒理机制。

1 仪器与材料

1.1 仪器

PMr10AD型倒置相差显微镜（日本Olympus公司）；JEM-1010型透射电镜仪（日本电子公司）；SYD-K2030型冷冻病理切片机（沈阳誉德电子仪器有限公司）；荧光定量聚合酶链式反应（PCR）仪（瑞士罗氏公司）；722型紫外分光光度计（上海天普分析仪器有限公司）。

1.2 试药

GTW片（湖南协力药业有限公司，批号:20050402）；Trizol RNA提取试剂（美国Invitrogen公司，批号:15596026）；LightCycle SYBR Green I RNA一步法扩增试剂盒和LightCycle质控盒（德国Roche公司）；基因引物由宝生物（大连）有限公司合成。

1.3 动物

SPF级SD大鼠，12周龄，♀，体重（260±10）g，由北京大学医学部实验动物部提供（动物生产许可证号:SCXK（京）2002-0001）。每日行阴道脱落细胞涂片，凡间隔4～5 d出现2次动情期者纳入实验。

2 方法

2.1 分组和给药

将大鼠随机分为正常（等容蒸馏水）和GTWⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ（5、10、20、50、75 mg·kg-1）组。除正常组外，其余各组ig相应GTW片水溶液，每天1次，连续28 d，第29天处死大鼠。

2.2 组织学观察

切取的卵巢组织用4%多聚甲醛固定，常规脱水、石蜡包埋、连续5µm切片后苏木精-伊红（HE）染色、封片，取最大剖面切片光镜下观察，并计数具有正常结构的各级卵泡数、卵泡总数及黄体数。卵泡分级方法参考文献[4，5]:小卵泡直径＜30µm，中卵泡直径30～600µm，大卵泡直径＞600µm；电镜组织经固定、冲洗、脱水、包埋、半薄切片定位后制成超薄切片，醋酸铀、柠檬酸铅双染色，透射电镜仪观察卵巢超微结构。

2.3 组织总RNA提取

总RNA提取:参照Trizol RNA抽提试剂盒说明书进行抽提。将卵巢组织加入液氮研磨后，加入1.5 mL trizol匀浆，加入氯仿振荡离心，取上层水相加入异丙醇静置离心，取沉淀加75%乙醇，振荡离心，倒掉乙醇吹干，加无RNA酶水振荡、离心、水浴再离心。完整性检测:取总RNA稀释液与Lodding buffer混合加入凝胶孔中电泳，紫外透射电镜仪上于254 nm波长处紫外光观察，完整的真核细胞核糖体RNA可见28、18、5 S 3条电泳带。纯度、浓度检测:取3 μL RNA样品稀释10倍，于紫外分光光度计探头上测定280/260（核酸/蛋白）、280/230（核酸/有机相）及浓度（ng·µL-1）数值。

2.4 Real-time PCR检测

FSHR、EGF和Cx43的基因引物序列见表1。

表1 FSHR、EGF和Cx43的基因引物序列Tab 1 The gene primer sequence of FSHR，EGF and Cx43

2.4.1 反应系统 （总量20µL）Mix SYBR GreenⅠ（4µL），Resolution Solution（2 µL），MgCl2stock solution（2.4 µL），Enzyme mix（0.4 µL），Primer（上下游）（各1 µL），Total RNA（阴性对照用水）（800 ng），H2O（PCR-grade）（可变化）。反应条件:55℃ 30 min，合成cDNA；95℃ 30 s孵育，56.1℃退火10 s，72℃延伸15 s，循环40次；60℃建立融解曲线。

2.4.2 目的基因检测 用建立的实时荧光PCR反应条件检测目的基因的循环阈（Ct）值，依照标准曲线计算起始模板拷贝数。定量PCR仪扩增完成后自动生成荧光强度曲线，该荧光强度曲线反映所有标本不同循环时的荧光强度，阳性标本呈现典型的S型曲线，阴性对照即使扩增50个循环也为不规则的波浪线。

2.5 统计学方法

数据采用SPSS 11.5统计软件进行分析处理。所有计量资料均以表示，两样本比较采用成组t检验。P＜0.05表示有统计学意义。

3 结果

3.1 组织形态学观察

光镜下观察，正常组卵巢内可见原始卵泡、生长卵泡、成熟卵泡等各级卵泡，卵泡排列紧密，未见明显的闭锁卵泡，黄体数目较多，血管丰富；GTWⅠ组与正常组相当；GTWⅡ组卵巢轻度间质纤维化改变，血管减少，小卵泡明显减少；GTWⅢ、Ⅳ、Ⅴ组卵巢间质纤维化改变明显，血管明显减少，各级卵泡及黄体明显减少。HE染色结果见图1。

图1 HE染色结果（HE×40）A.正常组；B.GTWⅠ组；C.GTWⅡ组；D.GTWⅢ组；E.GTWⅣ组；F.GTWⅤ组Fig 1 Results of HE staining（HE×40）A.normal group；B.GTWⅠ group；C.GTWⅡgroup；D.GTWⅢgroup；E.GTWⅣgroup；F.GTWⅤgroup

电镜下观察，正常组卵巢内卵泡排列紧密有序，卵泡膜清晰，胞质内可见丰富的线粒体及游离核糖体，细胞核圆形，有明显的核仁，染色质均匀；GTWⅠ组卵泡排列有序，卵泡膜清晰，颗粒细胞层丰富，结构清晰，胞质内细胞器丰富，细胞核较大，核仁明显，核染色质欠均匀；GTWⅡ、Ⅲ组细胞排列尚有序，细胞间隙稍增宽，胞质较丰富，细胞器轻度变性，线粒体空泡变较明显，核膜间隙增宽，核染色质欠均匀；GTWⅣ、Ⅴ组超微结构明显受损，卵泡细胞层次紊乱，大小不一，细胞间见明显间隙，胞质内细胞器减少且结构不清，部分细胞核呈斑块状凝集，细胞核异染色质凝集趋边，核膜不清。电镜下观察结果见图2。

图2 电镜下观察结果（TEM×6000）A.正常组；B.GTWⅠ组；C.GTWⅡ组；D.GTWⅢ组；E.GTWⅣ组；F.GTWⅤ组Fig 2 Observation results under electric microscope（TEM×6000）A.normal group；B.GTWⅠ group；C.GTWⅡgroup；D.GTWⅢgroup；E.GTWⅣgroup；F.GTWⅤgroup

3.2 各级卵泡、黄体计数比较

GTW各组小卵泡较正常组均显著减少，且小泡数量与用药剂量呈负相关；GTWⅠ、Ⅱ组大卵泡较正常组无明显减少，而GTWⅢ、Ⅳ、Ⅴ组均显著减少（P＜0.01或P＜0.05），且大泡数量与用药剂量呈负相关；除GTWⅠ组外，其他各组黄体均显著减少（P＜0.01或P＜0.05），且黄体数量与用药剂量呈负相关。大鼠各级卵泡和黄体计数的比较见表2。

表2 大鼠各级卵泡和黄体计数的比较Tab 2 The amounts of different levels follicles and corpus luteum in ovary

3.3 卵巢组织FSHR、EGF及Cx43 mRNA表达水平比较

GTW各组FSHR mRNA表达较正常组均无显著性差异；GTWⅠ、Ⅱ组EGF mRNA表达较正常组无显著性差异，其他各组均显著降低（P＜0.01或P＜0.05），且表达强度与用药剂量呈负相关；除GTWⅠ组外，其余各组Cx43 mRNA表达均显著降低（P＜0.01或P＜0.05），且表达强度与用药剂量呈负相关。卵巢组织FSHR、EGF及Cx43 mRNA表达的比较见表3。

4 讨论

表3 卵巢组织FSHR、EGF及Cx43 mRNA表达的比较Tab 3 The mRNA expression level of FSHR，EGF and Cx43 in ovary

既往研究表明，GTW导致生殖抑制的靶点在卵巢[1]。卵泡是卵巢功能的物质基础，卵泡数量及结构的改变对卵巢功能影响较大。原始卵泡数提示卵巢储备能力，窦状卵泡数则是对卵巢低反应性者的单一预测指标[6]。卵泡发育受卵巢血流影响，始基卵泡没有单独的血供，由基质血管传递营养物质和激素，故卵巢血流与卵巢反应密切相关[4]。因此，本研究采用卵巢组织病理学观察结合卵泡计数比较的方法评价GTW对卵泡发育的影响。结果表明，GTW导致卵巢血管减少，组织发生纤维化改变，卵泡颗粒细胞层减少，透明带模糊不清，提示GTW可导致卵母细胞发育环境受到损害；进一步观察显示卵泡细胞器减少且变性，组织呈明显的凝集性损害，提示卵母细胞本身亦受到了GTW的影响。对各级卵泡的计数比较显示，各剂量组小卵泡均明显减少，提示即使低剂量GTW亦可能对卵巢储备造成影响，而随用药剂量增大，则中、大卵泡数和黄体数明显减少，提示卵泡的发育与GTW用药剂量呈负相关。

FSH是刺激卵泡发育最重要的激素[7]，可促使窦前卵泡及窦状卵泡的颗粒细胞（GC）增殖与分化，缝隙连接形成、分泌卵泡液，使卵泡生长发育[8]。但FSH的生理功能需通过分布于性腺的特异性受体FSHR介导，因此FSHR的表达量直接影响卵巢对FSH反应性。卵母细胞不存在FSHR，FSH对其发育的调节必须通过旁分泌途径实现，EGF和Cx43是重要的中间环节，三者共同调节卵泡的发育。EGF可对FSH的促卵母细胞成熟作用有促进效应，而FSH能显著增加颗粒细胞中EGF的结合点，因此认为FSH对卵泡生长的调节是通过EGF及其受体来实现的[9]。卵泡处于无血管的微环境中，缝隙连接介导卵母细胞和其周围体细胞（颗粒细胞和卵泡膜细胞）间的代谢交换，传递内分泌和旁分泌的生长因子，GC通过缝隙连接持续低水平发送cAMP信号至卵母细胞，使卵母细胞滞留在减数分裂阶段，并通过LH诱导信号途径（也是一种缝隙连接）使卵母细胞最终成熟。因此，缝隙连接对于卵泡的发育以及甾类激素的分泌具有十分重要的意义。Cx43蛋白是卵巢组织表达最多的连接蛋白[10，11]。本研究表明，各GTW组FSHR mRNA表达较正常组均无显著性差异，而EGF及Cx43 mRNA表达较正常组显著下降，其表达量与药物剂量呈负相关，提示GTW并非通过降低卵巢对FSH反应性来影响卵泡发育，而是通过降低EGFmRNA表达影响FSH的旁分泌途径，并通过降低CX43mRNA表达影响卵母细胞和其周围体细胞间的代谢交换和内分泌、旁分泌生长因子的传递，从而影响卵泡的发育。

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