HPLC法测定人血浆中帕罗西汀的浓度

刘广军，杜贯涛，成金罗（南京医科大学附属常州第二人民医院，常州市 213003）

盐酸帕罗西汀（Paroxetine hydrochloride）化学名为:（－）-反式4-（4-氟苯基）-3{[3，4（甲二氧基）苯氧基]甲基}哌啶盐酸盐，是一种选择性5-羟色胺（5-TH）再摄取抑制剂（Selective serotonin reuptake inhibitor，SSRIs），其通过选择性地抑制神经元突触对5-HT的再摄取，使突触间隙5-HT浓度增加，促进传递功能，从而发挥治疗抑郁症、强迫症及惊恐症等精神疾病的作用。与传统的三环类抗抑郁药相比，SSRIs毒副作用较小，患者耐受性好，其治疗费用少，因此在临床上受到越来越广泛的应用[1～3]。为方便对帕罗西汀血药浓度的监测和药动学的研究。笔者利用现有的试验条件，建立了一种简便、快速、灵敏的测定人血浆中帕罗西汀浓度的高效液相色谱法。

1 材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪，包括Waters 2695泵、2487紫外检测器、Empower 2工作站（美国Waters公司）；T6型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；N-EVAP氮吹仪（美国Organomation公司）；Allegra.TM.21R型台式冷冻离心机（美国贝克曼库尔特有限公司）；Milli-Q纯水机（美国Millipore公司）；XH-C型涡旋混合器（江苏省金坛市医疗仪器厂）。

1.2 试药

帕罗西汀标准品（中国药品生物制品检定所，批号:100065-200505）；内标:盐酸舍曲林标准品（中国药品生物制品检定所，批号:100702-200401）；乙腈为色谱纯，磷酸二氢钾、氢氧化钠、磷酸均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Phenomenex Gemini C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），Phenomenex ODS 预柱（4 mm×3 mm）；流动相:0.05 mol·L－1磷酸二氢钾溶液（pH 3.5）-乙腈（62.5∶37.5）；检测波长:205 nm；流速:1 mL·min－1；柱温:35 ℃；进样量:40 μL。在该色谱条件下，盐酸帕罗西汀、盐酸舍曲林能够与杂质峰完全分离，色谱峰形良好，保留时间分别为6.3、10.2 min，血浆中杂质对测定不产生干扰。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图A.空白血浆；B.帕罗西汀标准溶液+内标溶液；C.患者服药后血样；1.盐酸帕罗西汀；2.盐酸舍曲林Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank plasma；B.paroxetine standard substance+internal standard；C.blood sample of patients after administration；1.paroxetine hydrochloride；2.sertraline hydrochloride

2.2 标准溶液的配制

准确称取盐酸帕罗西汀标准品及盐酸舍曲林标准品适量，分别配制成浓度为400 μg·mL－1和200 μg·mL－1的甲醇溶液作为标准贮备液和内标溶液，置4℃冰箱中保存备用。

2.3 血浆样品的处理

精密吸取1 mL血浆于10 mL离心管内，加入稀释成4 μg·mL－1的盐酸舍曲林内标溶液50 μL，涡旋混匀15 s，加甲醇0.5 mL后涡旋1 min，4500 r·min－1离心10 min，取上清液移入另一10 mL离心管中，加入0.1 mol·L－1氢氧化钠溶液 0.2 mL，涡旋30 s后加入正己烷5 mL涡旋2 min，4500 r·min－1离心10 min，取上清液4 mL于10 mL尖底试管内，40℃水浴中氮气流吹干，残渣用100 μL流动相溶解，取40 μL进行高效液相色谱测定。

2.4 标准曲线的制备

于健康人空白血浆中加入不同量的盐酸帕罗西汀贮备液并进行系列稀释，使最后的血浆浓度分别为0.00781、0.0156、0.0313、0.0625、0.125、0.25、0.5 μg·mL－1，然后按“2.3”项下方法操作，记录色谱。采用1/Y2权重以药物与内标峰面积比值（Y）对标准溶液浓度（X）加权回归，得标准曲线回归方程为Y＝1.795X－0.0019（r＝0.9994）。结果表明，盐酸帕罗西汀血药浓度在0.00781～0.5µg·mL－1范围内线性关系良好；帕罗西汀的最低定量限为0.2 μg·mL－1。

2.5 回收率及精密度试验

2.5.1 方法回收率:于健康人空白血浆中加入不同量的盐酸帕罗西汀贮备液并进行系列稀释，使最后的血浆浓度分别为0.00781、0.0625、0.5 μg·mL－1，按“2.3”项下方法操作，记录帕罗西汀与内标峰面积比值（Y），代入回归方程，计算方法回收率（以测得量与加入量的比值计算回收率），结果见表1。

表1 回收率及精密度试验结果（n＝5）Tab 1 Results of recovery and precision tests（n＝5）

2.5.2 萃取回收率:按“2.5.1”项下方法配制成高、中、低3种浓度的血浆样品，按“2.3”项下方法操作，记录帕罗西汀峰面积As；另用流动相制备盐酸帕罗西汀标准溶液（浓度分别为0.00781、0.0625、0.5 μg·mL－1），进样并记录峰面积Ai，以As/Ai计算萃取回收率，结果见表1。

2.5.3 精密度试验:按“2.5.1”项下方法配制成高、中、低3种浓度的血浆样品，按“2.3”项下方法操作，记录帕罗西汀峰面积与内标峰峰面积的比值，分别考察在同日内和5 d内的精密度，结果见表1。

2.6 稳定性试验

按“2.5.1”项下方法配制成高、中、低3种浓度的血浆样品作为质控样品，以进行稳定性考察。对样品室温放置0、4、8、24 h，冰箱冷藏5 d后，反复冻融3次后测定，结果帕罗西汀RSD均＜5%，表明未发生明显降解。

2.7 测定实例

5例患者口服帕罗西汀1周后，使用剂量为每日10 mg，达稳态后取血，使用本方法处理并测得其血药浓度分别为9.08、19.36、8.11、7.34、29.60 ng·mL－1，说明本测定方法可行。

3 讨论

在选择内标时，笔者同时考察了苯妥英钠、卡马西平、地西泮、舍曲林等多个药物，经综合考虑内标结构、性质、吸收曲线等因素后，最终确定以舍曲林为内标，二者分离度良好且能够与杂质峰分离，系统理论板数较高。

文献常用萃取方法多用有机溶剂直接提取，本试验参考了相关文献[4～6]，试用了多种有机溶剂提取血样中的帕罗西汀，分别考察了醋酸乙酯、乙醚、二氯甲烷、正庚烷、正己烷等。研究发现，用有机溶剂直接提取后，杂质较多，进样后容易堵塞色谱柱，造成柱压升高，峰形改变等。故本试验采用先用甲醇沉淀后再用有机溶剂提取法，文中使用正己烷萃取，可以有效减少样品中杂质，提取回收率也较高。试验也发现随浓度的升高，萃取回收率有下降的趋势，可能与萃取效率下降有一定关系，与之对应的是，方法回收率也有与此类似的趋势，但是不影响试验的准确性。

本试验通过优化流动相，并选择合适内标及提取溶剂，对已报道的高效液相色谱法进行了改进，具有操作简便，杂质干扰少，准确度、灵敏度高等优点。可用于盐酸帕罗西汀在人体内的血药浓度测定及药动学研究。

[1]周翠玲，王利群，谢惠君.帕罗西汀的临床应用进展[J].中国新药与临床杂志，2003，22（1）:53.

[2]梅浙川，李晋芳，冯晓霞，等.常规治疗与合用帕罗西汀治疗功能性消化不良伴抑郁焦虑障碍的临床疗效观察[J].中国药房，2005，16（18）:612.

[3]杜 彪.循证医学方法研究氟西汀与帕罗西汀治疗抑郁症的成本-效果[J].中国药房，2005，16（17）:1309.

[4]彭文兴，符棘玉，蒋丽丽，等.HPLC-MS法测定血浆中的帕罗西汀及人体内药动学研究[J].中国药学杂志，2003，38（11）:868.

[5]朱 军，刘伟忠，杨 鸿，等.帕罗西汀片在健康人体的药代动力学[J].南方医科大学学报，2008，28（2）:260.

[6]Juan H，Zhiling Z，Huande L.Simultaneous determinalion of fluoxetine，citalopram，paroxetine，venlafaxine in plasma by high-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry（HPLC-MS/ESI）[J].J Chromatogr B:Analyt Technol Biomed Life Sci，2005，820（1）:33.