PRRSV GP5蛋白抗独特型单链抗体的构建表达及鉴定

于 颖，王 刚，宋腾飞，孔 宁，马晓春，姚永红，肖一红*，周恩民,2*

(1.山东农业大学动物医学院，山东 泰安 271018；2.西北农林科技大学动物医学院，陕西 杨凌 712100)

猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒(Porcine reproducitive and respiratory syndrome virus，PRRSV)为有囊膜的单股正链RNA病毒，属于动脉炎病毒科(Arteriviridae)动脉炎病毒属(Arterivirus)，含有6个结构蛋白。其中表面蛋白(GP5)和基质蛋白(Matrix)可能是诱导中和抗体的主要病毒抗原[1]。

独特型(Idiotype，Id)是存在于抗体和T，B淋巴细胞表面受体可变区(V)内的抗原决定簇。Jerne提出的免疫网络学说认为，机体内通过一系列Id和其抗独特型(Anti-Id或Ab-2)的正反馈或负反馈来调节机体对某一抗原的免疫反应[2]。感染了PRRSV的猪血清中有两种不同的抗GP5的自身抗独特型抗体(auto-Ab2)，在针对PRRSV感染的免疫网络中起到正向或负向调控作用[3-4]。本实验室前期采用顺序免疫法制备的针对PRRSV GP5抗原的MAb2-5G2可以特异性结合PAM和MA-104细胞[5]。MAb2-5G2通过正反馈调控机体对抗PRRSV感染的细胞和体液免疫反应，提高感染高致病性PRRSV的断奶仔猪成活率达50%以上。本研究构建表达了MAb2-5G2的scFv，并证明该scFv可以被兔抗MAb2-5G2抗体，即Ab3识别，复性后的scFv蛋白能够特异性结合Marc-145细胞。为进一步深入研究其所识别的细胞蛋白与PRRSV感染细胞的关系及在猪体内调控免疫系统抵抗PRRSV的感染提供了条件。

1 材料和方法

1.1 材料及试剂 鼠源杂交瘤细胞MAb2-5G2由本实验室制备；E.coliTop10、BL21 Rosetta菌株由本室保存；pEasy-E1载体、DNA Marker、TransTaq HiFi DNA聚合酶和鼠源抗His单克隆抗体(MAb)购自北京全式金公司；TRIzol试剂和M-MLV反转录酶购自TaKaRa公司；DMEM基础培养基、胎牛血清购自Invitrogen；CNBr活化的琼脂糖凝胶6MB购自GE公司；HRP标记的羊抗鼠二抗和羊抗兔二抗均购自北京康地恩公司。

1.2 引物设计 根据鼠源抗体基因家族可变区的骨架区(FR)和互补决定区(CDR)氨基酸序列特点及文献[6]，设计并合成扩增抗体重链和轻链可变区基因的引物。分别在重链可变区基因的下游引物和轻链可变区基因的上游引物以重叠基因的形式设计连接子以便连接(表1)。

表1 PCR引物名称及序列Table 1 Primers used for the PCR and RT-PCR

1.3 兔抗MAb2-5G2抗体(Ab3)的制备 2只体质量为2.0 kg的新西兰大白兔，每只各免疫2 mg MAb2-5G2，每两周免疫一次，共免疫3次，3次免疫后收集兔血清备用。分别将MAb2-5G2和无关IgG偶联到CNBr活化的琼脂糖凝胶上制备成免疫亲和层析柱[7]。将免疫后兔血清通过偶联无关鼠源IgG的免疫亲和柱除掉抗Fc抗体，收集未结合抗体柱的液体经偶联MAb2-5G2的抗体柱得到特异性结合MAb2-5G2可变区的抗体，即Ab3。

1.4 抗体可变区基因的扩增及阳性克隆的筛选鉴定采用TRIzol法提取MAb2-5G2杂交瘤细胞总RNA，反转录制备cDNA。以cDNA为模板，分别利用引物HF、HB和LF、LB通过RT-PCR扩增重链可变区基因VH和轻链可变区基因VL。VH和VL基因PCR产物经胶回收后与pMD18-T连接转化至E.coli Top10感受态细胞中，重组质粒经PCR鉴定为阳性后测序鉴定。

1.5 scFv重叠PCR扩增及其原核重组表达质粒的构建 以胶回收的VH和VL基因片段互为模板进行PCR扩增。 PCR反应体系为50 μL：VH和VL模板各 1 μL，dNTPs(2.5mmol/L)4 μL，10×Trans TaqHiFi Buffer 5 μL，TransTaqHiFi DNA 聚合酶0.5 μL，去离子水38.5 μL。PCR反应程序为：94℃5 min；94℃ 30 s、58℃ 1 min、72℃ 1 min，7个循环；加入引物HF和LB各1 μL，进行PCR反应。反应程序为：94℃ 5 min；94℃30 s、58℃1 min、72℃1 min，18个循环；72℃10 min。扩增的scFv目的片段经胶回收纯化后与pEasy-E1连接，转化至E.coliTop10中。提取重组质粒，经PCR鉴定为阳性后测序，重组质粒命名为pEasy-scFv。

1.6 pEasy-scFv的诱导表达及纯化 将pEasy-scFv转化BL21 Rosetta感受态细胞。经0.5 mol/mL的IPTG诱导培养4 h，离心收集菌体，超声裂解，进行SDS-PAGE鉴定。表达蛋白进行Ni-resin纯化。

1.7 重组scFv蛋白的复性及鉴定

1.7.1 重组蛋白的pH和尿素双梯度复性 纯化后的scFv蛋白包涵体用尿素梯度为8 mol/L～2 mol/L及pH梯度为6～8.5的复性溶液在16℃条件下进行双梯度透析复性，每个梯度透析12 h进行复性。

1.7.2 Western blot鉴定 SDS-PAGE电泳后的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，分别用鼠源抗His的MAb和兔源抗体Ab3为一抗(经纯化的针对MAb2-5G2可变区的抗体)，分别以HRP标记的羊抗鼠二抗和羊抗兔二抗进行western blot分析鉴定，同时设空载体重组菌为阴性对照。

1.7.3 IFA鉴定复性scFv蛋白的活性 将Marc-145细胞铺板后固定；各20 μg的MAb2-5G2、复性的scFv、未复性的scFv分别加入A、B、C孔中孵育；B和C孔中再加入鼠抗His MAb作为一抗；最后加入FITC羊抗鼠抗体进行荧光分析鉴定。

2 结果

2.1 PCR扩增可变区基因 以反转录得到cDNA为模板进行PCR扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳显示VH和VL分别在390 bp左右出现特异性片段，与预期大小相符(图1)。

图1 VH和VL基因的扩增Fig.1 Amplification of VH and VL genes

2.2 原核重组表达质粒的构建 以纯化后的VH和VL基因互为模板，利用VH 3'端和VL 5'端的引物上的重叠基因通过重叠PCR扩增得到scFv基因(图2)。将scFv片段与pEasy-E1连接构建重组表达质粒pEasy-scFv，测序结果表明scFv为762 bp。

图2 SOE法扩增scFv基因Fig.2 Amplification of scFv gene by SOE-PCR

2.3 scFv基因诱导表达 pEasy-scFv经IPTG诱导4 h，SDS-PAGE电泳结果显示表达的重组蛋白(scFv-His)约30 ku。经Ni-Resin纯化后的重组蛋白与预测相符(图3)。

图3 重组scFv的表达Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant scFv

2.4 重组蛋白scFv的复性及鉴定

2.4.1 重组蛋白scFv的western blot分析 SDS-PAGE电泳后的蛋白转移至硝酸纤维素膜，分别用鼠源抗His MAb和Ab3进行western blot检测。结果显示，在分子量约30 ku处均出现特异性反应条带，表明scFv得到了正确表达，可以被Ab3识别，且具有良好的反应原性(图4)。

图4 重组scFv的western blot鉴定Fig.4 Western blot analysis of recombinant scFv

2.4.2 重组蛋白scFv的IFA鉴定 IFA结果显示，阳性对照抗体(MAb2-5G2)和复性后的scFv蛋白(20 μg)具有相同结合Marc-145细胞的能力，而未复性的scFv蛋白不能结合Marc-145细胞(图5)。

3 讨论

图5 重组scFv的IFA鉴定Fig.5 IFA analysis of recombinant scFv

scFv是利用连接肽把抗体重链可变区和轻链可变区连接成的具有抗原结合位点的最小的抗体片段。本实验利用RT-PCR方法从分泌PRRSV抗独特型抗体的杂交瘤细胞中克隆抗体可变区基因具有正确的小鼠抗体骨架区和互补决定区的结构，与Ig-BLAST中小鼠抗体可变区基因同源性达90%以上。鉴于VH-linker-VL比VL-linker-VH的亲和力高10倍以上[8-9]，本研究选用了Huston根据X射线晶体衍射分析抗体可变区结构的15肽序列(Gly4Ser)3作为连接肽[10]，克隆出抗独特型抗体单链抗体基因VH-linker-VL，并制备能够保持该抗独特型抗体亲和性和特异性的scFv。该scFv蛋白质量约为30 ku，能够与兔抗MAb2-5G2抗体，即Ab3特异性结合。同时，复性的scFv蛋白经过二硫键正确折叠保持了它与MAb2-5G2 IgG相同的识别PRRSV易感细胞Marc-145的结合能力。

目前，PRRS的防制主要依靠弱毒苗和灭活苗的接种。弱毒苗可提供良好的保护效力，但存在毒力返强的风险，而灭活苗的效果并不稳定[11-12]。MAb2-5G2可能作为PRRSV GP5的“内影像”分子，既可模拟抗原表位而发挥免疫作用，又避免了诱导细胞凋亡的缺点，具有潜在的应用价值；而单链抗独特型抗体与抗独特型抗体相比，具有分子量小，无毒性，易于穿入组织细胞，易在大肠杆菌中大量表达的优势。我们在证明经过复性的原核表达的scFv具备MAb2-5G2的免疫学功能的基础之上，将继续构建MAb2-5G2 scFv的真核表达系统，通过真核表达的MAb2-5G2 scFv研制抗独特型抗体疫苗及深入研究新型PRRSV受体与PRRSV感染宿主细胞的关系。

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