联合检测外周血癌胚抗原mRNA及livin mRNA对早期发现大肠癌微转移肿瘤的意义研究

肖 维，彭 健，张阳德

大肠癌包括结肠癌和直肠癌，为临床常见的恶性肿瘤，而且其发病率呈上升趋势［1］。大肠癌血液微转移肿瘤的早期发现与大肠癌的预后密切相关［2］，但是目前仍然缺乏高度特异性和灵敏性的早期诊断的实验室检查指标［3］。本研究通过反转录聚合酶链式扩增 (RT－PCR)法检测大肠癌患者外周血液中癌胚抗原 (CEA)mRNA和livin mRNA的表达情况，探讨二者对早期发现大肠癌血液微转移肿瘤的意义，指导临床对大肠癌的诊疗，对其预后做出客观的判断。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2009年2月—2010年3月就诊于中南大学湘雅医院肝胆肠外科的初发、初治大肠癌患者60例为研究对象，均经肠镜或手术病理检查证实;同时选取同时期30例大肠良性疾病 (息肉、腺瘤、肠炎、憩室等)患者为大肠良性疾病组和30例健康体检正常者为对照组。大肠癌组男32例，女28例;年龄30～76岁，平均年龄 (56±3)岁;结肠癌25例，直肠癌35例;低中分化36例，高分化24例;Dukes A+B期31例，Dukes C+D期29例;有局部淋巴结转移11例，无局部淋巴结转移49例;有远处转移13例，无远处转移47例。大肠良性疾病组男17例，女13例;年龄22～73岁，平均年龄 (51±6)岁;息肉14例，腺瘤9例，肠炎5例，憩室2例。对照组男18例，女12例，年龄27～69岁，平均年龄 (49±7)岁。3组在性别及年龄方面具有均衡性。

1.2 主要试剂及仪器 Trizol试剂 (GIBCO公司)，PCR引物、RT－PCR试剂盒由大连宝生生物公司合成和生产，电泳仪为北京六一公司产品，紫外分光光度仪、PCR仪为美国Thermo产品，凝胶成像系统为美国Bio－RAD公司产品。

1.3 方法

1.3.1 CEA、livin和内参GAPDH引物设计及合成 根据genebank提供的基因信息，利用引物设计软件Primer 5.0自行设计引物，交由大连宝生生物公司合成，序列如表1所示。

表1 PCR引物序列及扩增长度Table 1 PCR primer sequences and amplification length

1.3.2 总RNA提取 患者入院第2天抽取肘静脉血5 ml，采血管肝素钠抗凝，去酶处理。采血后1 h内利用淋巴细胞分离液分离细胞，参照说明书使用Trizol试剂提取细胞总RNA，紫外分光光度仪测定其纯度和浓度，1%琼脂糖凝胶电泳实验鉴定RNA的完整性。

1.3.3 RT－PCR法检测CEA mRNA和livin mRNA的表达应用大连宝生生物公司生产的TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0两步法试剂盒进行RT及PCR，分别为10μl和40μl体系，按照试剂盒说明书步骤进行，RT反应条件:30℃×10 min，42℃ ×30 min，99℃ ×5 min，5℃ ×5 min，1个循环。PCR扩增反应条件:94℃ ×2 min，1个循环，再94℃ 30 s，61℃ 30 s，72℃ 30 s。共40个循环，延伸72℃ 5 min。最后所得产物在含0.45μg/ml溴化乙啶的1%琼脂糖凝胶中电泳分离 (100 V，45 min)，紫外凝胶成像系统拍照观察和分析结果。

1.4 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行数据处理，计数资料采用χ2检验，以p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RNA完整性及纯度鉴定结果 1%琼脂糖凝胶电泳实验显示所有RNA皆有5 S、18 S和28 S3条带，28 S条带亮度最高 (见图1)，证实RNA完整性良好。紫外分光光度计测得所有样本RNA的A 260/A 280处于1.8～2.0，证明RNA纯度较高，排除蛋白质及DNA污染。

2.2 大肠癌组、大肠良性疾病组和对照组CEA mRNA和livin mRNA的表达情况 60例大肠癌患者中CEA mRNA阳性表达率为58.3%(35/60)，livin mRNA阳性表达率为61.6%(37/60)。大肠良性疾病组和对照组中CEA mRNA和livin mRNA均无阳性表达。3组CEA mRNA和livin mRNA阳性表达率比较，差异均有统计学意义 (p＜0.05)。CEA mRNA和livin mRNA的RT－PCR扩增见图2。

图1 大肠癌组、大肠良性疾病组和对照组RNA电泳图Figure 1 RNA electrophoresis figure of colorectal cancer group，benign disease group and control group

图2 CEA mRNA和livin mRNA的RT－PCR扩增图Figure 2 RT－PCR figure of CEA mRNA and livin mRNA

2.3 大肠癌组患者CEA mRNA和livin mRNA的表达与临床特征的关系 大肠癌患者外周血中CEA mRNA和livin mRNA的表达与性别、年龄、肿瘤分化程度及肿瘤部位无明显相关性(P＞0.05);而与肿瘤的临床分期、有无淋巴结和远处转移有关 (p＜0.05，见表2)。即肿瘤临床分期越晚，出现淋巴结和远处转移，CEA mRNA和livin mRNA的阳性表达率越高。

2.4 CEA mRNA和livin mRNA联合检测与单一检测阳性率比较 大肠癌患者CEA mRNA和livin mRNA双阳性20例，CEA mRNA阳性而livin mRNA阴性15例，CEA mRNA阴性而livin mRNA阳性17例。CEA mRNA和livin mRNA联合检测阳性率为86.7%(52/60)，与CEA mRNA单项阳性率58.3%(35/60)及livin mRNA单项阳性率61.6%(37/60)比较，差异均有统计学意义 (χ2值分别为12.079和9.786，p＜0.05)。

表2 大肠癌组患者CEA mRNA和livin mRNA的表达与临床特征的关系Table 2 Relationship between CEA and livin mRNA expression and clinical features in colonrectal cancer patient

3 讨论

大肠癌为临床常见肿瘤，目前主要治疗手段包括手术治疗、化疗、放射治疗等。研究表明，大肠癌5年生存率约为50%，即使临床病变较早期的病理检测淋巴结阴性的患者，5年内仍有20% ～30% 死于转移或复发［4］。大肠癌的复发与转移很大程度上与肿瘤微转移有关［5］。分析其原因有:(1)大肠癌早期发病没有症状或者症状轻微，容易导致患者的忽视，常规检查不能较早的检测出处于早期或者隐匿期的大肠癌。然而早期肿瘤已经存在微转移肿瘤［6］。(2)已经确诊为大肠癌的患者，即使接受了正规的手术或者放化疗治疗，可能在治疗之前就已经存在了微肿瘤的局部或者远处的血道转移，而这些微转移灶是常规病理细胞形态学和免疫组织化学检查还不能发现的［3］。

CEA是一种特异性较高的肿瘤相关抗原，大约95%大肠癌有CEA基因的表达，CEA在小细胞肺癌、乳腺癌等中也有表达。目前，CEA mRNA被广泛用于大肠癌微转移检测。Wang等［7］研究发现大肠癌患者外周血CEA mRNA的阳性表达率为72.2%，特异性为100.0%，其阳性表达率可独立预测术后转移，与肿瘤侵润深度、血管侵犯和TNM分期显著相关。Sadahiro等［8］通过长期随访研究发现，大肠癌根治术后7～10 d外周血CEA mRNA仍然阳性患者其术后复发率明显增高，无病生存 (DFS)和总生存 (OS)明显差于CEA mRNA阴性患者。朱元祺等［9］研究发现结肠癌患者外周血中CEA mRNA阳性表达率为45.0%，在健康人体内无表达，CEA mRNA阳性表达率与肿瘤分期相关。

细胞的凋亡受抗凋亡蛋白如Bcl－2家族和凋亡抑制蛋白(IAP)家族的调控［10］。livin是IAP家族中新近发现的一种凋亡蛋白，可以通过抗死亡受体途径、抗线粒体途径和激活JNKl信号转导等途径发挥抑制细胞凋亡和抵抗肿瘤放化疗作用［11］。livin在成人的正常组织中几乎不表达，而在肿瘤组织表达明显上调［12］。许多 livin基因表达与肿瘤的研究显示，livin基因显著表达于膀胱癌、小细胞肺癌、肝癌、大肠癌等恶性肿瘤，且其表达水平的高低与肿瘤的恶性程度、转移及预后情况相关［13－14］。

本研究利用RT－PCR技术检测CEA mRNA和livin mRNA的表达，结果显示，CEA mRNA和livin mRNA在大肠良性疾病患者和健康者外周血中均无表达，而在大肠癌患者中阳性表达率分别为58.3%(35/60)和61.6%(37/60)。CEA mRNA和livin mRNA的表达均与患者性别、年龄、肿瘤分化程度及肿瘤部位无明显相关性，而随着肿瘤的Dukes临床分期越晚，出现局部和远处转移，CEA mRNA和livin mRNA表达增高。由此推测，CEA和livin可能与肿瘤的转移和复发有关，外周血中CEA mRNA和livin mRNA的检测有助于发现早期血道微转移，其在外周血中的表达可能是大肠癌恶化发生复发转移所伴随的分子生物学变化。因此，通过检测大肠癌CEA mRNA和livin mRNA的表达有助于大肠癌的早期诊断及微转移灶的发现。

Xu等［15］采用实时荧光定量RT－PCR技术检测大肠癌患者外周血CK20 mRNA、CK19 mRNA、CEA mRNA的表达水平，发现即使在早期肿瘤患者的外周血中都有较高的阳性率，同时联合检测2个或3个指标时，可以极大地提高阳性检出率，对于检测早期大肠癌血液循环中的肿瘤细胞有意义。本研究结果显示，单独检测CEA mRNA或livin mRNA，阳性检测率分别为58.3%和61.6%。而联合检测阳性检出率提高到86.7%。因此，联合检测CEA mRNA和livin mRNA的表达对于大肠癌早期诊断和血液中微转移肿瘤的发现具有重要意义，进而可以预测大肠癌患者预后。同时，由于CEA mRNA和livin mRNA的表达与肿瘤的分期有关，表达阳性可以提示血液微肿瘤的存在，可以动态观察大肠癌患者血液中CEA mRNA和livin mRNA的表达，有助于指导临床治疗。

总之，利用RT－PCR技术检测外周血中CEA mRNA和livin mRNA的表达能够早期诊断大肠癌和早期发现微转移肿瘤，进而指导临床治疗，判断预后。

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