补充蒺藜提取物对过度训练大鼠T淋巴细胞亚群和NK、NKT细胞的影响

孙婧瑜 杨文吉 王茹 曲静 游盛中 王晓慧

上海体育学院运动科学学院（上海 200438）

过度或激烈运动会降低机体免疫力，出现运动性免疫抑制（exercise-related immunosuppression），所以训练或比赛后常有运动员抵抗力下降，出现感染性疾病，如上呼吸道感染、病毒性肝炎等，影响其运动能力，甚至停训停赛。因此寻找合适的解决方法避免或改善运动性免疫功能抑制，对提高运动员运动能力具有重要意义。

蒺藜有草中名药之称，它含有皂苷类、黄酮类和甾醇类等化合物，皂苷是蒺藜的主要有效成分。现代药理学研究发现，蒺藜皂苷有性强壮、降血压、降血脂和抗动脉粥样硬化等作用［1］。关于蒺藜调控免疫功能及其机制的相关研究刚开展，有限的研究认为，蒺藜水提取物能显著增强巨噬细胞的吞噬功能［2］；蒺藜皂苷能增强机体自然杀伤细胞活性，预防老年人免疫功能降低［3］。蒺藜是否能改善过度运动所致的运动性免疫抑制尚无报道。本实验选择T淋巴细胞CD3+、CD4+/CD8+比值、辅助性T细胞（Th）1/Th2细胞平衡以及NK细胞、NKT细胞数量等免疫学指标，研究了蒺藜提取物对过度训练所致的运动性免疫抑制大鼠免疫功能的影响，以探讨蒺藜提取物对过度训练导致的运动性免疫抑制的调节作用及其机制，为开发蒺藜作为过度训练的免疫改善制剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

30只健康雄性SD大鼠购自上海第二军医大学动物中心［实验动物使用许可证号SYXK（沪）2007－0003］，8周龄，随机分为安静对照组、过度训练组和蒺藜+过度训练组3组，每组10只。

1.2 实验方法

1.2.1 训练方案

对照组不进行任何运动训练。过度训练组和蒺藜＋过度训练组正式实验前先进行3天跑台适应性训练。正式训练方案参照Bedford方法［4］改良，采用6周递增强度运动训练，其强度、坡度和持续时间分别为15 m/min、5%、30 min（第1周）；20 m/min、5%、60 min（第2周）；25 m/min、10%、90 min（第3周）；30 m/min、15%、90 min（第4周）；30 m/min、15%、120 min（第5周）；35 m/min、15%、120 min（第6周）。每周训练6天，休息1天。

1.2.2 蒺藜提取物的补充方式

蒺藜提取物（含总皂苷60%以上）购自西安三维生物技术有限公司，将其配制成浓度为24 mg/ml的溶液。每次训练前30 min，过度运动+蒺藜组以120 mg/kg体重的剂量灌胃服用蒺藜提取物，对照组和过度训练组灌服等体积的生理盐水。

1.2.3 取材及指标检测

体重检测：每周一上午用天平称量各组大鼠体重。

内分泌激素检测：第7周周一上午大鼠眼眶静脉丛采血0.5 ml后用ELISA试剂盒（上海申能博采生物科技有限公司）检测外周血皮质酮（C）、睾酮（T）水平。按试剂盒说明书进行操作。

免疫细胞检测：第7周周一上午，使用肝素真空采血针抽取大鼠腹主静脉血，并向100 µl抗凝血中加入20 µl抗体，混匀后25℃恒温器中孵育1 h，溶红细胞后放入恒温器10～20 min，1500 r/ min离心5 min，取上清液用生理盐水洗1～2次，1500 r/ min离心5 min后上流式细胞仪（美国贝克曼公司）检测CD3+、CD4+、CD8+、NK、NKT细胞数及IFN-、IL-4分泌量。

1.3 统计学分析

采用SPSS13.0统计学软件包分析实验数据，结果用平均数±标准差表示，过度训练组分别与安静对照组和蒺藜+过度训练组比较，采用单因素方差分析，显著性水平为P < 0.05，非常显著性水平为P < 0.01。

2 结果

2.1 大鼠外观状态、体重及内分泌指标

过度训练组第4、5、6周各有1只大鼠死亡，原因不清；蒺藜+过度训练组第5周有2只死亡。实验后期，过度训练组大鼠反应迟钝，精神萎靡不振，眼神暗淡无光，毛发脱落等，而蒺藜+过度训练组大鼠也出现相似表现，但程度比过度训练组轻。

表1显示，实验前（0周）各组大鼠体重无显著性差异，从第3周开始过度训练组大鼠体重显著低于安静对照组（约是对照组的82%，P < 0.01），至第6周时约是对照组的76%（P < 0.01）。第4周和第6周蒺藜＋过度训练组大鼠体重与过度训练组比较显著增加（P < 0.05），但仍显著低于安静对照组（P < 0.01）。

表1 3组大鼠实验期间体重的变化

表2显示，与过度训练组相比，蒺藜+过度训练组睾酮水平显著增加（P < 0.05），皮质酮水平显著降低，约是过度训练组的一半，且低于安静对照组（P < 0.05），T/C比值大幅增加，是安静对照组的1.95倍（P < 0.01）。

表2 3组大鼠血浆睾酮、皮质酮及T/C比值比较

2.2 免疫指标

2.2.1 CD3+细胞数及CD4+/CD8+比值

表3显示，蒺藜＋过度训练组大鼠CD+/CD+48比值显著增加，远超过安静对照组，是其水平的2.04倍。蒺藜＋过度训练组大鼠CD3+T淋巴细胞数量与过度训练组比较虽有增加趋势，但无显著差异，且仍显著低于安静对照组（P < 0.05）。

表3 3组大鼠CD3+细胞数及CD4+/CD8+比值比较

2.2.2 IFN-γ和IL-4

如表4所示，与安静对照组相比，过度训练组大鼠Th1型特征性细胞因子IFN-和Th2型特征性细胞因子IL-4均显著增加（P < 0.01），IFN-/IL-4比值显著降低（P < 0.05），表明过度训练大鼠Th1/Th2失衡，向Th2方向漂移；而补充蒺藜提取物后过度训练大鼠IFN-水平显著增加（P < 0.01），IL-4水平显著降低（P < 0.01），IFN-/IL-4比值明显升高，接近安静对照组水平。

表4 3组大鼠IFN-和IL-4比较

表4 3组大鼠IFN-和IL-4比较

*P < 0.05，**P < 0.01：与安静对照组比较；#P < 0.05，# #P <0.01：与过度训练组比较。

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2.2.3 NK、NKT细胞数

表5显示，与过度训练组相比，蒺藜+过度训练组大鼠NK、NKT细胞均显著增加（P < 0.05），NKT细胞数量显著高于安静对照组（P < 0.05）。

表5 3组大鼠NK、NKT细胞数比较

3 讨论

3.1 6周递增负荷运动导致运动性免疫抑制模型的建立

大鼠运动性免疫抑制模型的成功建立是本研究的基础。因此，我们首先检验6周递增负荷运动后大鼠是否出现过度训练。本实验结果表明，过度训练大鼠体重显著降低，运动后期反应迟钝，精神萎靡不振，眼神暗淡无光，毛发脱落等，血浆T/C比值明显下降，表明大鼠出现了过度训练；结合CD3+T淋巴细胞和NK细胞数量明显减少、Th1/Th2失衡说明本实验的运动方案成功建立了过度运动所致的运动性免疫抑制动物模型。

3.2 蒺藜提取物对过度训练大鼠免疫功能的影响

T淋巴细胞在细胞免疫反应中有重要作用，T细胞数量增加和CD4+/CD8+比值升高反映免疫功能改善。本研究发现，与过度训练组比较，蒺藜+过度训练组大鼠CD4+/CD8+比值明显增加，是安静对照组的2倍左右，但CD3+T细胞数量仅有增加趋势，无统计学意义，表明蒺藜提取物通过增加CD4+/CD8+比值增强过度训练大鼠的免疫功能。

Th1细胞主要负责细胞免疫，Th2细胞与体液免疫有关。IFN-、IL-4被认为是Th1细胞和Th2细胞的特征性因子，因此用IFN-/IL-4比值反映Th1/Th2平衡情况［5，6］。Mueller等发现重复性力竭运动可导致竞技运动员IFN-下降，使Th1/Th2平衡向Th2漂移，导致免疫功能下降［7］。多个实验室也得到了类似的结果［5，8，9］。目前认为过度运动所致的运动性免疫抑制是因为过度运动抑制Th细胞向Th1分化，促进其向Th2分化，使Th1/Th2平衡向Th2漂移，导致细胞免疫功能降低而体液免疫增强所致［5，8，9］。本研究显示过度训练组大鼠IFN-/IL-4比值显著降低，Th1/Th2平衡向Th2方向漂移，此与前人研究结果一致。而补充蒺藜提取物后过度训练大鼠IFN-/IL-4比值显著上升，表明蒺藜可改善由于过度训练导致的Th1/Th2失衡，使其不向Th2方向漂移，促进Th1/Th2恢复平衡。

NK细胞是具有自然杀伤能力的淋巴细胞，在机体免疫防御反应中起重要作用。NKT细胞是特殊类型的T细胞亚群，其细胞表面既有T细胞受体，又有NK细胞受体。运动可导致免疫细胞发生数量及功能变化，而免疫细胞中以NK细胞变化最敏感，可以作为早期诊断运动性疲劳的监测指标［10，11］。NKT也是反映运动后免疫功能改变的较敏感指标，受运动强度和运动量影响［12，13］。本研究发现补充蒺藜提取物可使大鼠NK、NKT细胞数量显著增加，甚至超过安静对照组水平，表明蒺藜提取物通过增加NK、NKT细胞数量改善过度运动大鼠免疫功能。增加的NKT细胞不仅有助于CD8+杀伤性T细胞的分化［14］，而且大大增强了NK细胞的杀伤活性［15］，提高机体免疫功能。

3.3 蒺藜提取物增强过度训练大鼠免疫功能的可能机制

作为免疫抑制剂的糖皮质激素能促进淋巴细胞、巨噬细胞的凋亡，抑制炎症因子的分泌，从而抑制免疫功能，而糖皮质激素对运动中免疫功能的抑制作用也得到多篇文献的证实。长时间大强度运动后出现的免疫抑制与糖皮质激素的浓度升高有关［16］；糖皮质激素的浓度与马拉松运动员运动后1.5 h和3 h的循环淋巴细胞的数量呈负相关关系［17］；运动后增加的糖皮质激素降低NK细胞的数量［18］以及降低踏车小鼠颌下淋巴结CD3+T淋巴细胞数量［19］；次最大强度踏车运动所致的糖皮质激素的增加与其促进胸腺细胞和脾细胞的凋亡有关［20］；糖皮质激素通过影响运动过程中的Th1/Th2不同细胞因子的分泌，使Th1/Th2失衡，向Th2漂移［21，22］等。以上结果表明糖皮质激素的升高至少是运动性免疫抑制发生的原因之一。本实验发现与过度训练组大鼠相比，蒺藜＋过度训练组大鼠血浆皮质酮水平明显降低（约为过度训练组的50%），伴有免疫功能显著增强；而过度训练大鼠血浆皮质酮水平有升高的趋势并伴有免疫功能降低，因此，推测蒺藜提取物对免疫功能的增强作用很可能与其降低皮质酮水平有关。至于过度训练组大鼠的血浆皮质酮水平没有显著增加的原因，可能与采血时间较晚（在运动后的第3天上午采血，约是运动后38小时），升高的血浆皮质酮水平已有所恢复有关。

4 总结

蒺藜提取物增强过度训练大鼠受抑制的免疫功能，包括增加过度训练大鼠血浆CD4+/CD8+比值和NK、NKT细胞数量，促进Th1/Th2失衡的改善，使其恢复平衡。蒺藜提取物对过度训练大鼠免疫功能的增强作用很可能与其降低血浆皮质酮水平有关。

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