胃癌组织中抑癌及相关基因的表达及其临床意义

马 骏 聂胜男 张建波 孟 凯 王明玉

肿瘤的发生和转移是1个复杂的过程，其中涉及到多种癌基因的激活和抑癌基因的失活［1］。nm23作为抑癌基因，通过影响微管聚合状态及G蛋白介导的信号通路而调节细胞代谢，在肿瘤细胞的增殖、分化和侵袭转移中起重要作用［2］。E-cadherin作为另1种肿瘤转移抑制基因，与nm23能够协同抑制胃癌的转移［3］。CD44是1种细胞表面黏附分子，标准型CD44(CD44s)主要在间质和造血细胞中表达，为透明质酸盐的主要受体，CD44s及其变异体可在多种肿瘤中表达［4］。本研究应用免疫组化技术，检测 nm23和 E-cadherin及CD44s基因在胃癌组织中的表达，分析其与胃癌临床病理因素的关系，旨在探讨nm23和E-cadherin及CD44s基因在胃癌的发生和转移等过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 标本来源

选取泰安市中心医院2006年07月～2010年07月手术切除、并经病理检查确诊的50例胃癌标本。所有患者术前均未行化疗或放疗，并有完整的临床病理资料。男性32例，女性18例。年龄25～72岁，平均年龄59.1岁，中位年龄61岁。根据UICC(1997年)第5版胃癌TNM分期标准:Ⅰ期10例，Ⅱ期20例，Ⅲ期12例，Ⅳ期8例。肿瘤细胞组织学分化:高分化癌22例，中分化癌15例，低分化癌13例。有淋巴结转移25例，无淋巴结转移25例。选取30例胃癌组织标本的相应癌旁组织(距离癌灶≥2 cm)作为对照组，所有癌旁组织标本均经病理检查证实为癌旁正常组织。

1.2 主要试剂

鼠抗人nm23和CD44s单克隆抗体购自武汉博士德生物技术有限公司，鼠抗人E-cadherin(MAB-4A2)为丹麦DAKO公司产品(1∶80稀释);SP试剂盒、DAB显色剂均为SantaCruz公司产品。免疫组化染色程序按试剂盒说明书进行操作。

1.3 实验方法

4%甲醛固定标本，石蜡包埋，4μm厚连续切片。免疫组化SP法检测步骤:3%H2O2作用20 min，消除内源性过氧化酶活性;0.01 mol/L PBS(pH=7.4)漂洗2 min×3次;10%正常羊血清37℃孵育2 h;PBS液冲洗5 min;Envision混合液室温孵育2 h;DAB显色。PBS代替一抗作为阴性对照，用已知nm23和E-cadherin及CD44s阳性表达的胃癌组织切片作为阳性对照。

1.4 结果判断标准

nm23阳性表达信号为棕黄色或深棕色，阳性产物定位于细胞质和细胞膜，呈弥散性分布;E-cadherin和CD44s阳性染色定位于细胞膜，阳性信号为棕黄色颗粒状。所有切片均采用双盲观察，阳性细胞数＜5%，无染色或染色较弱，为阴性(－);阳性细胞数≥5%，染色较强，则为阳性(+)。

1.5 统计学方法

对实验数据采用χ2检验和Spearman相关分析，数据计算应用SPSS12.0统计学软件。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 胃癌组织中各基因的表达情况

胃癌组织中 CD44s阳性表达率为44.5%(22/50)，癌旁组织中其阳性表达率为13.3%(4/30)，两者比较差异有统计学意义，χ2=4.23，P ＜0.05。胃癌组织中nm23基因阳性细胞染色为黄色，定位于细胞质和胞膜。胃癌组织中其阳性表达率为48.0%(24/50)，癌旁组织中其阳性表达率为63.3%(19/30)，两者比较差异有统计学意义，χ2=5.89，P ＜0.05。胃癌组织E-cadherin阳性染色定位于细胞膜，为棕黄色颗粒状。胃癌组织中E-cadherin阳性表达率为52.0%(26/50)，癌旁组织为70.0%(21/30)，两者比较差异有统计学意义，χ2=9.45，P ＜0.05。

2.2 CD44s、E-cadherin及nm23基因阳性表达与胃癌组织临床病理特征的关系

nm23基因表达与肿瘤组织分化程度相关，随着肿瘤组织分化程度的增加而增强，P＜0.001;Ⅰ+Ⅱ期胃癌组织中nm23阳性表达率要高于Ⅲ+Ⅳ期组织，差异有统计学意义，P=0.02;无浆膜浸润胃癌组织中其表达率要高于有浆膜浸润者，P=0.012;无淋巴结转移者其表达率高于有淋巴结转移者，P=0.001。CD44s阳性表达与肿瘤有无浆膜浸润、淋巴结转移和TNM 分期相关，χ2值分别为 11.62、12.58 和 9.78，P均＜0.05;CD44s阳性表达与胃癌组织分化程度无关，P＞0.05;E-cadherin阳性表达与胃癌组织分化程度、有无浆膜浸润、淋巴结转移和TNM分期相关，P均＜0.05(表 1)。

表1 抑癌及相关基因阳性表达与胃癌组织临床病理特征的相关性(例，%)

2.3 CD44s与nm23表达的相关性

Spearman相关分析显示，胃癌组织CD44s表达与nm23表达呈一定程度的负相关性(γ=－0.287，P＜0.05)，nm23表达与E-cadherin表达呈正相关性(γ=0.928，P=0.000)。

3 讨论

肿瘤的转移是1个非常复杂的过程，涉及一系列基因，包括转移抑制基因和转移促进基因。其中，nm23 和 E-cadherin 是较为明确的转移抑制基因［4，5］。nm23基因的缺失和突变与胃癌肿瘤的浸润和转移有关，并与短的生存期相关［6］。nm23的编码产物为二磷酸核苷激酶(NDPK)，nm23/NDPK可介导GDP向GTP的转化，而这一过程与G蛋白的活性有关。Ayabe等［7］研究发现，nm23-H1基因对肺癌淋巴结微转移可能具有抑制作用。E-cadherin与nm23有协同作用。本研究中，nm23和E-cadherin在胃癌组织中的阳性表达率均低于癌旁组织中的阳性表达率，差异有统计学意义。nm23和E-cadherin基因的阳性表达率与胃癌组织学分级、分化程度、淋巴结转移和临床分期等密切相关，提示其在胃癌的转移瘤形成阶段具有抑制肿瘤转移的作用。

CD44基因位于染色体11号短臂上(11P)，共有20个外显子构成。有关研究表明多种肿瘤的转移行为均与CD44基因的异常转录有关，CD44v6是CD44蛋白变异体，它是分布极为广泛的细胞表面跨膜糖蛋白分子主要参与细胞与细胞、细胞与基质间的特异性黏附过程［2］。有文献报道，胃癌组织中CD44s表达率为64% ～77%，而且与肿瘤的浸润转移密切相关［3，4］。本研究结果显示，胃癌组织 CD44s阳性表达率为44.5%，在有、无淋巴结转移组织中的阳性率分别为56.0%和32.0%，差异有统计学意义，提示胃癌伴淋巴结转移者CD44s表达较高。而在有、无浆膜浸润组织中表达率分别为51.7%和33.3%，差异有统计学意义，说明CD44s与胃癌组织的浸润程度有相关性。

CD44s和nm23属于黏附分子范畴，CD44s在肿瘤组织生物学行为上的作用，与黏附因子之一整合素的作用呈协同作用［8］。整合素是1种膜镶嵌糖蛋白，由α和β两个亚单位非共价形成异二聚体复合物。由于亚单位的变异使整合素形成1个庞大的家族。有的参与不同细胞之间的黏附连接(异源细胞间黏附)，有的则协助细胞与细胞外基质的结合，其中24β1和Mac 1同时具备上述2种功能。细胞表面的整合素可处于不活化状态，有一些活化因子可增强整合素与相应配体的亲和力，CD44s则属于这种强化因素之一，因而，在一定程度上影响肿瘤细胞转移潜能的高低。nm23与上皮黏连素和金属蛋白酶组织抑制物的基因被视为肿瘤转移抑制基因［9，10］。上皮黏连素抑制肿瘤细胞转移的作用主要是使肿瘤细胞彼此胶着在一起，使细胞之间黏附增加，瘤细胞不易脱落而发生侵袭和转移。有关nm23抗肿瘤转移的机制以及CD44s和nm23在肿瘤侵袭和转移中存在怎样的协同或拮抗作用，有待于进一步研究。本研究显示，胃癌组织CD44s与nm23基因的表达呈一定程度的负相关性，nm23与E-cadherin基因表达呈正相关性。

本研究通过检测胃癌组织CD44s和E-cadherin及nm23基因的表达，发现CD44s和E-cadherin及nm23表达与胃癌肿瘤组织分期、浸润程度和淋巴结转移等相关，检测其表达有助于临床预测胃癌的转移和侵袭程度。

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