近红外光谱法快速测定红参提取物中的总糖含量

2011-05-02高荔，孔伟

药学研究 2011年5期

高荔，孔伟

(1.山东省卫生厅，山东济南 250014;2.山东省立医院，山东济南 250021)

1 引言

前期实验表明，在按研究工艺提取的红参提取物中总糖的平均含量能达到50%以上，HPLC－ELSD分析显示主要为麦芽糖、蔗糖和果糖。实际检验中测定红参提取物中总糖含量的主要方法为比色法，过程复杂，费时费力。近红外光谱法作为一种新型的绿色分析技术，已在各行各业取得了很大发展［1］，不仅在中药的定性［2］和定量［3］方面取得了一定的成就，且成功地用在了多种药材总糖含量的测定上［4，5］。本文对近红外光谱技术测定红参提取物中总糖含量的方法进行了初步研究，结果满意。

2 实验材料和方法

2.1 实验仪器和材料 Bruker Tensor 37型近红外光谱仪(德国布鲁克公司)，积分球附件，定量分析软件为Opus 6.5;HACH DR5000紫外分光光度计(美国哈希公司);Mettler XS105电子天平(瑞士梅特勒公司)。无水葡萄糖对照品(中国药品生物制品检定所提供，批号110833－200503);试剂均为色谱纯，水为超纯水。

红参提取物样品(实验室自制，制备方法:红参饮片加8倍量95%乙醇提取3次，时间为3 h、3 h、2 h。合并提取液，减压回收乙醇至无醇味，加水至约相当于原药材相等重量的体积，冷藏12 h后过滤，滤液减压浓缩后减压干燥，得红参提取物50批，分别编号为1～50。前40批为校正集样品，后10批作为预测用样品)。

2.2 近红外光谱的采集扫描50批样品的近红外光谱。具体参数为:光谱仪扫描波长范围4000～12000 cm－1，扫描次数32次，分辨率8 cm－1，以仪器自带镀金背景为参比，积分球漫反射扫描方式，每份样品扫描4张，取其平均光谱，50批红参提取物的近红外光谱见图1。

2.3 总糖的测定采用硫酸－苯酚法测定红参提取物中总糖含量，具体方法如下。

图1 50批红参提取物的近红外光谱图

供试品溶液制备:取红参提取物约1 g，精密称定，加水溶解并定容至25 mL。精密量取5 mL加到处理过的AB－8大孔树脂柱上(80目;柱内径8 mm;树脂柱高约3 cm)，用水冲洗，流速约为1～2 mL·min－1，流出液收集于100 mL量瓶中，加水定容至刻度，混匀。

对照品溶液的制备:精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品适量，加水制成每1 mL含0.1 mg的溶液，摇匀。

标准曲线的制备:精密吸取对照品溶液 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，置10 mL具塞试管中，分别加水至1 mL，精密加入5%苯酚水溶液1 mL，混匀;沿管壁精密缓慢加浓硫酸5 mL，迅速混匀，至沸水浴中放置10 min，取出置冰水浴中放置10 min，取出，室温放置10 min，以相应试剂为空白在490 nm波长处测定吸收度。

测定法:精密吸取供试品溶液0.4 mL，加水0.6 mL，照标准曲线的制备项下方法，自“各精密加入5%苯酚水溶液1 mL”起，同法操作测定吸收度，计算，即得。方法学考察结果见表1。结果40批校正集样品中总糖(以葡萄糖计)含量分布为 41.3%～67.8%。

表1 总糖方法学考察结果

3 结果与讨论

3.1 光谱预处理方法选择为了消除光谱散射效应和基线飘移对近红外谱图的影响，本实验比较了多元散射校正(MSC)、矢量归一化法和导数光谱法，以及两种处理方法相结合的多种预处理方法，以模型的决定系数(R2)、内部交叉验证均方差(RMSECV)作为评价指标［6］(R2越接近 100、RMSECV值越小，模型的精确度越高)，不同预处理方法下的R2和RMSECV结果见表2。

表2 不同预处理方法的比较

3.2 光谱波段和最佳维数的选择在Opus软件自动优化的基础上，通过不断调节，比较不同校正模型的决定系数(R2)和内部验证均方差(RMSECV)，R2越接近于100说明模型的预测值越准确，RMSECV越小说明模型预测精度越高。最终发现在波段7499～11993 cm－1范围内，最佳维数为7时，能有效提取光谱中的特征信息，消除仪器不稳、环境变化和样品不均等带来漂移和波动。图2为校正集的Rank与RMSECV之间的趋势图。

3.3 模型的建立将40批红参提取物的含量测定结果导入OPUS数据处理软件，使用上述优选参数，运用PLS建立总糖的定量分析模型，用内部交叉验证法对模型进行验证，图3为40批模型的预测值与化学测定值之间的相关图，样品均匀分布在回归线的两侧，内部交互验证结果R2为88.71，RMSECV 为 1.03。