酿酒酵母表达基因工程抗菌肽Pa-AMP05的抗菌活性研究

2011-04-28深圳市圣西马生物技术有限公司郑文官董清风彭永鹤李永新

中国饲料 2011年6期

深圳市圣西马生物技术有限公司张捷郑文官黄杰董清风彭永鹤李永新

抗菌肽在体外可直接杀灭病原微生物，具有广谱抗菌活性：不仅可以抗革兰氏阳性菌（G+）、革兰氏阴性菌（G-）和真菌、原虫等多种病原微生物，还可以抗肿瘤和癌细胞，甚至可以直接杀灭流感、疱疹等有包膜的病毒，是宿主防御外界病原体入侵的重要分子屏障。目前抗菌肽已在医药、食品防腐、化妆品及动物养殖领域等应用。基因工程抗菌肽Pa-AMP05为酿酒酵母分泌型表达，主要存在于发酵液的上清液中，具有多项免疫功能（王凯等，2009a，b；皮灿辉等，2008）及较高的稳定性，且动物试验表明，其可以显著促进动物生产性能和健康水平（李永新等2009，罗治华等，2009）。本实验通过琼脂扩散法、微量稀释法和常量稀释法，对其抗菌活性进行研究，以此确证基因工程抗菌肽Pa-AMP05的高效抗菌性能。

1 材料与方法

1.1 实验材料基因工程抗菌肽Pa-AMP05发酵液（抗菌肽含量：500 μg/L）由深圳市圣西马生物技术有限公司提供。指示菌大肠杆菌ATCC25922与金黄色葡萄球菌ATCC29213由华南农业大学兽医学院提供。

1.2 实验方法

1.2.1 基因工程抗菌肽Pa-AMP05发酵过滤液的制备吸取10 mL的基因工程抗菌肽Pa-AMP05发酵液原液分装到离心管，10000 r/min离心10 min，经孔径为0.22 μm无菌滤膜过滤，备用。

1.2.2 大肠杆菌和金黄色葡萄球的制备将大肠杆菌和金黄色葡萄球接入LB液体培养基中，37℃培养，使其菌数达到1×109CFU/mL备用。

1.2.3 琼脂扩散法参照药敏试验中琼脂打孔扩散法，把金黄色葡萄球菌和大肠杆菌原菌液浓度调至1×105CFU/mL，将细菌均匀涂布到LB培养基上，将灭菌的不锈钢小管（外径为5 mm）放置在培养基上打孔，将孔中的培养基用灭菌针头挑出，并以火焰封底，使培养基能充分与平皿融合（以防药液渗漏，影响结果）。

加样：1号和2号孔分别加入发酵过滤液，阳性（+）孔加入抗生素(100 μg/mL Zeocin，Invitrogen）、阴性（-）孔加入空载体酵母发酵过滤液，各加至满而不溢为止。

将平皿培养基置于37℃温箱中培养15 h后，观察抑菌结果并测量抑菌圈直径。

1.2.4 微量稀释法检测抗菌肽抗菌活性

1.2.4.1 最小抑菌浓度（MIC）的测定把已培养好的大肠杆菌与金黄色葡萄球菌原菌液用LB液体培养基稀释到 1000倍（1×106CFU/mL）。

在96孔板每个孔加入空白LB液体培养基100 μL。根据设计的实验浓度，在第一列加入100 μL 待测样品，吸取 100 μL 至第二孔，上下吹打，混合均匀后吸取100 μL至第三孔，第4～8孔操作相同，最后100 μL弃去。这样每孔对应的体积分数为 1、1/2、1/4、1/8。第 9孔和第 10孔分别做阳性对照（青霉素钠）和阴性对照（灭菌水）。抗生素（青霉素钠200 μg/mL）操作方法同上。最后在每孔中加入100 μL稀释好的菌液，放入恒温培养箱中过夜培养。

1.2.4.2 结果判断以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。当阳性对照孔（即不含抗菌物质）内细菌明显生长试验才有意义。当在微量肉汤稀释法出现单一的跳孔时，应记录抑制细菌生长的最高药物浓度。如出现多处跳孔，则不应报告结果，需重复试验。

1.2.5 常量稀释法检测抗菌肽抗菌活性参照药敏试验中常量肉汤稀释法，略有改动。

1.2.5.1 培养物的制备及培养检测按照不同稀释比例：1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64 配置含有发酵过滤液的LB液体培养基，分为7个平行管，其中3管按1%接种量接入大肠杆菌，另3管按1%接种量接入金黄色葡萄球菌，同时留一管作为对照管，不接菌种。

以无菌水与2倍浓度LB培养基按1∶1混合溶液作为阴性对照，以无菌水为检测OD600值所用参比样品。将以上所有试管封口后放入37℃的恒温摇床（250 r/min）里培养12 h，检测其OD600值。

1.2.5.2 抗菌活性的检测终OD600值=样品OD600值-相应消除管OD600值。

1.2.5.3 抗菌肽浓度与抗菌活性的线性关系测定将检测得到的终OD600值与抗菌肽发酵过滤液稀释倍数做线性回归分析，根据R2值判断二者是否具有线性关系，以此证明抗菌肽浓度与抗菌活性的线性关系。

2 数据与结果

2.1 琼脂扩散法检测基因工程抗菌肽Pa-AMP05抗菌活性实验发现，抗菌肽对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有较好的抑菌效果。其对金黄色葡萄菌的抑菌圈直径大小为12 mm，与抗生素阳性对照（100 μg/mL Zeocin）相同。对大肠杆菌的抑菌圈大小为15 mm，与抗生素阳性对照（100 μg/mL Zeocin）相同。

2.2 微量稀释法检测基因工程抗菌肽Pa-AMP05抗菌活性通过微量稀释法检测出抗菌肽及青霉素钠的MIC值，结果见表1所示。

表1 微量稀释法检测基因工程抗菌肽Pa-AMP05抗菌活性

结果测得青霉素钠对金黄色葡萄球菌的MIC 值为：3.125 μg/mL，对大肠杆菌的 MIC 值为：25 μg/mL。抗菌肽对金黄色葡萄球菌MIC值均为15.625 μg/mL，对大肠杆菌的MIC值均为31.25 μg/mL。

2.3 常量稀释法检测基因工程抗菌肽Pa-AMP05抗菌活性结果见表2。结果表明，以基因工程抗菌肽发酵过滤液的稀释倍数为横坐标，分别以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌培养液的OD600值为纵坐标，做线性回归分析，结果如图1、2。结果表明，回归方程分别为y=0.0206x-0.0952，R2=0.967；y=0.0051x+0.0234，R2=0.9749，即抗菌肽浓度与抗菌活性呈一定的线性正相关关系。

3 结论

目前，琼脂扩散法、微量稀释法和常量稀释法为常用的抗菌活性检测方法，通过测定发现，基因工程抗菌肽Pa-AMP05具有较强的抑制大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的活性，对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度（MIC）为 15.625 μg/mL，对大肠杆菌的最低抑菌浓度（MIC）为31.25 μg/mL；同时检测的青霉素钠对金黄色葡萄球菌的MIC值为：3.125 μg/mL，对大肠杆菌的 MIC 值为：25 μg/mL。通过线性回归分析表明，基因工程抗菌肽Pa-AMP05的浓度与抗金黄色葡萄球菌活性呈一定的线性正相关关系。本试验中由于抗菌肽Pa-AMP05对大肠杆菌的MIC值低于对金黄色葡萄球菌的MIC值，做回归方程所选取的数据，稀释倍数最高达到64倍，远远高于抗菌肽Pa-AMP05对大肠杆菌的MIC值范围，导致回归方程截距为负值，但是这并不影响其线性关系的判断，即抗菌肽Pa-AMP05的抗菌活性强弱可以反映出发酵液中抗菌肽浓度的高低。此试验结果说明，基因工程抗菌肽Pa-AMP05对所选取的代表性G+、G-具有很好的抑菌活性，具有广谱的抗细菌性能。