黄芪汤对酒精性肝纤维化大鼠 TNF-α及 TGF-β1的影响

时代音 胡春婷 何 娅 西安交通大学医学院第二附属医院干部病房(西安 710004)

酒精已是继病毒性肝炎之后导致肝损伤的第二大原因。酒精性肝纤维化导致肝硬化速度更快,发病率高,只要在肝纤维化阶段而非延误至中晚期肝硬变进行合理治疗,完全可以达到逆转肝纤维化进程,进而缓解乃至治愈肝纤维化的目的。本研究以大鼠为对象,观察黄芪汤对酒精性肝纤维化大鼠血清及肝组织转化生长因子、肿瘤坏死因子的影响,旨在揭示酒精性肝纤维化发病机制,并为中药黄芪汤治疗肝纤维化提供依据。

1 材 料 1.1 药品:黄芪汤由西安交通大学医学院第二附属医院中药房提供,黄芪汤由黄芪 30g,丹参 15g,白术、茯苓 12g,葛根 10g,甘草 6g组成。上述药材加蒸馏水常规煎煮去渣,浓缩成每毫升含生药 2g,4℃保存。大鼠用药剂量为成人 5倍。

1.2 动物:健康 6周龄大鼠,体质量 200±10g。由西安交通大学医学院第二医院动物中心提供。

1.3 试剂与仪器:肿瘤坏死因子α(TNF-α)、转化生长因子 β(TGF-β1)试剂盒,由武汉博士德生物工程有限公司提供。放射免疫计数器由上海核辐光电仪器有限公司提供。电动玻璃匀浆机由宁波新芝科器研究所提供。

2 方 法 2.1 动物分组:大鼠在室温 22±1℃,湿度50± 5%的实验室用平衡饲料喂养 1周后随机分为 3组:酒精性肝纤维化模型(下称模型组,n=15);酒精性肝纤维化模型加黄芪汤干预组(下称治疗组 n=15);正常对照组 (n=15)。

2.2 剂量选择与受试物给予方式:从造模开始,黄芪汤按3g/Kg给大鼠灌胃。同时对照组给予等体积生理盐水。

2.3 动物处理:大鼠经适应性喂养 1周后,根据文献制备大鼠酒精肝纤维化动物模型,除正常对照组外,其它各组动物给予 400mL/L乙醇溶液 8g/kg◦ d,分 3次灌胃至 4周末。第 5周开始,将乙醇浓度增至 500mL/L,9g/kg◦ d,分 3次灌胃至第 8周末。第 9周开始 ,500mL/L,10g/kg◦ d,分 3次灌胃至第12周末。正常对照组给予生理盐水 10mL/kg,日 1次灌胃 ,模型组:500mL/L乙醇 10g/kg.d分 2次灌胃,至第 16周末,末次给药后禁食 12h,大鼠麻醉后经腹主动脉取血,分离血清待测。参照试剂盒说明书严格进行。肝组织匀浆的制备及保存:采血后每鼠在肝右叶取约 0.5g肝组织,在低温条件下剪碎,放入匀浆器中,再加入 9倍体积的冷生理盐水。研成匀浆后,倒入离心管中,低温低速离心机 3000r/min离心 30min。取上清液待测。组织学标本的制备:取肝左叶,用甲醛固定 ,石蜡包埋,切片。

2.4 血清和肝组织检测 TN F-α、TGF-β1用放射免疫法。

2.5 病理组织学检查一部分肝组织固定于多聚甲醛溶液中,做 HE染色,按照 2000年 9月西安会议制定的《病毒性肝炎防治方案》进行纤维化程度分期:0期,无纤维化;S1,汇管区扩大,轻度纤维化;S2,汇管区周围纤维化,纤维隔形成,小叶结构保留;S3,纤维隔伴小叶结构紊乱,无肝硬化;S4,早期肝硬化。采用双盲法制片,对记分进行统计。

3 结 果 在 16周的大鼠喂养过程中,正常对照组大鼠全部存活,模型组和治疗组各死去 8只。各组血清和肝脏匀浆(TNF-α)和转化生长因子 (TGF-β1)见表 1、表 2。

表1 各组大鼠血清及肝组织 TNF-α变化 (ng/mlx±s)

表1 各组大鼠血清及肝组织 TNF-α变化 (ng/mlx±s)

△治疗组和模型组与正常对照组相比较 P＜0.01,▲模型组与治疗组比较 P＜0.01

组 别 血清 肝组织正常对照组模型组治疗组18.96±1.56 33.28± 2.12△26.76± 1.23▲94.62±14.4 146.63± 22.8△113.79± 12.65▲

表2 各组大鼠血清及肝组织 TGF-β1变化 (mg/Lx±s)

表2 各组大鼠血清及肝组织 TGF-β1变化 (mg/Lx±s)

治疗组和模型组与正常对照组相比较 P＜0.01,▲模型组与治疗组比较 P＜0.01

组 别 血清 肝组织正常对照组模型组治疗组103.69±31.26 256.23± 21.32△218.93± 28.06▲423.96±68.72 735.19± 164.14△620.51± 89.96▲

表3 各组肝纤维化分级及半定量计分

讨 论 酒精性肝纤维化在发病机制上也有许多学说。酒精诱导的细胞因子和炎症介质在肝脏炎症中发挥着重要作用,从本研究可以看出,酒精性肝纤维化大鼠血浆和肝脏中肿瘤坏死因子(TNF-a、转化生长因子 (TGF β1)明显升高。Kupffer细胞(肝巨噬细胞)是酒精性肝纤维化产生的主要细胞,它的激活是肝细胞进一步损伤的重要机制之一。酒精不能直接激活Kupffer细胞,但可以通过嗜酒者肠道内细菌的内毒素脂多糖(LPS)来激活。LPS同血液中结合蛋白(LBP)形成复合物,与效应细胞-库弗细胞表面的受体 CDl4相结合 ,在识别受体 T LR4的参与下进行信号转导,经胞内一系列相关信号分子的参与最终使核转录因子进入细胞核,启动炎症因子的转录,从而导致肝脏炎症损伤。炎症介质可以引起肝细胞进一步坏死、凋亡、炎症和肝纤维化形成。

中医学虽无酒精性肝纤维化之称,但散在论述于“伤酒”、“胁痛”、“酒癖”、“酒鼓”、“黄疸”等病证之中,有其独特的治疗方法。中医认为慢性肝病发展至肝纤维化,进而出现门脉高压、硬化的过程,是一个由络伤气滞,进而发展至痰湿阻络。正所谓“初病气结在经,久病络伤入血”。病邪留滞、气血失调、脏腑受损三者相互影响,互为因果,构成慢性肝病的整体病理基础。肝藏血 ,主疏泄,体阴而用阳,脾主运化,为后天之本,生化之源。肝脾正常保证了机体气机升降,气血生成、输布及局部的结构濡养;病理时机体失养 ,气郁血结 ,脾运失健,生化乏源,促使肝病不断进展。中药黄芪汤以“补气健脾、活血化瘀”为主,治疗酒精性大鼠肝纤维化 16周,与对照组相比较有显著差别。同时中药黄芪为君药,主要体现代医学对酒精性肝病的认识。黄芪中含有微量元素硒,硒能提高谷胱甘肽过氧化物酶活性,激活解毒酶系,从而对肝细胞起保护作用。黄芪可保护肝脏粗面内质网,并使粗面内质网增加 ,抑制核糖核酸酶活性,从而促进蛋白质合成。并能保护肝细胞膜,降低血清转氨酶.臣药丹参具有改善抗肝细胞损伤、免疫调节的作用;丹参酚酸 B可抑制星状细胞增殖及 I型胶原分泌与总胶原的沉积、抑制转化生长因子的生成。茯苓、白术有免疫调节作用;佐葛根是中国传统医学中最具代表性的解酒药物。使药甘草调和诸药。

总之,黄芪汤对大鼠酒精性肝纤维化有保护作用。

参考资料

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