大蒜汁对枯草芽孢杆菌芽孢形成和发芽的影响

王君,韩静

(1.山西农业大学食品科学与工程学院,山西太谷 030801;2.山西农业大学 工学院,山西太谷 030801)

芽孢杆菌是经常遇到的污染菌,而且有的还是致病菌;它们可以引起果蔬、粮食、乳制品、肉类、鱼类、禽类、蛋类以及罐头食品的变质和一些食源性疾病和食物中毒[1,2]。如:蜡状芽孢杆菌(B.cereus)污染牛乳后可使其酸度不高时即可发生凝固,而且产生下痢疾毒素、肠毒素、溶血素、呕吐毒素及肠管坏死毒素等引起食物中毒。巨大芽孢杆菌(B.megaterium)可使浓缩乳凝固并产生干酪味的气味,使肉类罐头变质胀罐。肉类罐装食品中最重要的是肉毒梭状芽孢杆菌(Cl.botulinum),其芽孢耐热性极强,能产生很强的毒素——肉毒毒素,人们食入含有该毒素的食品可发生毒素型食物中毒,早期症状为全身无力、头痛、头晕,继而出现眼睑下垂、视力模糊、瞳孔散大、吞咽困难等症状直至死亡。

由于芽孢具有高度抗逆性,因此杀灭芽孢成为衡量各种消毒灭菌手段的最重要的指标。大量的现代医学和食品研究资料都证实,大蒜对芽孢杆菌属有明显的抑制效果。目前国内外学者关于对芽孢杆菌属的抑制作用大多集中于对营养细胞的抑制作用研究上,较少关注芽孢。故本试验采用大蒜原汁为材料研究其对枯草芽孢杆菌芽孢形成和芽孢发芽的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis AS 1.1380)。

紫皮大蒜(Allium sativum L.),购于陕西省岐山县蔡家坡。

磷酸氢二钠,磷酸二氢钾,冰乙酸,乙酸钠,硫酸亚铁铵,抗坏血酸,均为分析纯。

蛋白胨,酵母浸膏,琼脂,均为生化试剂。

2,6-吡啶二羧酸色测反应剂[3]:pH5.5,0.5 mol◦L-1乙酸钠缓冲液100 mL,抗坏血酸、硫酸亚铁铵各1 g,每次实验前现配。

大蒜原汁制备:将大蒜洗净,去皮,用压榨机压榨,无菌滤纸过滤,取出原汁,置冰箱保存备用。

1.2 方法

1.2.1 枯草芽孢杆菌的显微镜镜检

当芽孢杆菌的细胞停止生长时,就开始形成芽孢。通过显微镜芽孢染色[4]观察细菌不同时间生长期的形态变化,以确定其对数生长期每一个阶段的具体时间,从而间接确定其芽孢形成的开始时期,为芽孢形成的试验提供可靠数据。

1.2.2 蒜汁对B.subtilis芽孢形成[5]影响

分别将菌悬液配成106cfu◦mL-1和104cfu◦mL-1两个稀释度作对比试验,按接种量0.5%接入液体培养基培养,当培养液中细菌处在对数生长期(11 h)时,将大蒜原汁按不同浓度加入到培养液中,37℃培养不同时间,取出后立即在80℃条件下加热10 min,杀死营养细胞,再进行梯度稀释,用平板菌落计数法计数[6]。

1.2.3 蒜汁对2,6-吡啶二羧酸(DPA)的影响

取试验1.2.2中经过大蒜汁处理的菌悬液混合液(106cfu◦mL-1稀释度)5 mL,立即离心(3000 r◦min-1)30 min分离菌体,加5 mL无菌水,在 121 ℃加热30 min,冷却后加入1 mol◦L-1醋酸0.1 mL,室温下静置1 h,再离心(3000 r◦min-1)30 min,往4 mL上清液中加1 mL的DPA色测反应剂,于440 nm下测定其OD值[3]。

1.2.4 蒜汁浓度对B.subtilis芽孢发芽[5]的影响

取制备好的芽孢悬液[7](104cfu◦mL-1)一定量,于80℃加热10 min热激活芽孢后,迅速冰水冷却,在不同发芽时间与不同浓度大蒜汁中孵化30 min,梯度稀释后,用平板菌落计数法计数[6]。

1.2.5 蒜汁处理B.subtilis的时间对其芽孢发芽[5]的影响

用试验1.2.4的方法将芽孢热激活后,迅速冰水冷却,在不同发芽时间与浓度为1%的大蒜汁处理不同时间,用平板菌落计数法计数[6]。

2 结果和分析

2.1 枯草芽孢杆菌的显微镜镜检结果

通过对比开始形成芽孢时期和芽孢发芽后的镜检图(图1和图2),确定培养枯草芽孢杆菌11 h时,是芽孢形成的开始时期。

将制备好的芽孢悬液进行芽孢染色镜检,以确定芽孢悬液中无营养细胞,镜检结果见图3。镜检结果表明制备的芽孢悬液已无营养细胞,可用于芽孢发芽的试验。

图1 开始形成芽孢时期的镜检图(11 h)Fig.1 Micrograph of beginning sporulation(11 h)

图2 芽孢形成后的镜检图(15 h)Fig.2 Micrograph of sporulation(15 h)

图3 芽孢悬液镜检图Fig.3 Micrograph of spore suspension

2.2 蒜汁对B.subtilis芽孢形成的影响

从图4可以看出,当蒜汁浓度为1%,菌悬液浓度为104cfu◦mL-1时,其抑制时间持续到48 h时仍有一定的抑制性,平板菌落数与空白对照相差10倍。从图5中可以看出,当菌悬液浓度为106cfu◦mL-1时的各大蒜汁处理液与菌作用时间超过24 h后,这种抑制作用消失,结果都与空白一致。综合分析可知,大蒜汁对枯草杆菌的芽孢形成有重要影响作用。在大蒜汁与菌作用时间相对较短时,大蒜汁浓度越高,芽孢形成的数量越少,其抑制芽孢形成的时间越长。

图4 蒜汁对芽孢形成的影响/104cfu◦mL-1Fig.4 Effectofsporulation on sensitivity of B.subtilis to garlic juice

图5 蒜汁对芽孢形成的影响/106cfu◦mL-1Fig.5 Effectofsporulation on sensitivity of B.subtilis to garlic juice

2.3 蒜汁对2,6-吡啶二羧酸(DPA)的影响

DPA是芽孢中的一种重要物质,在芽孢形成的后期才合成,其含量一定,很少随培养条件的变化而变化[8],故可通过DPA浓度的变化间接衡量成熟芽孢数量的多少。从图6试验结果中发现大蒜汁处理过的枯草芽孢杆菌中芽孢所含DPA量的变化趋势比空白对照晚12 h。综上分析,大蒜汁对枯草芽孢杆菌的芽孢形成影响主要是延缓了芽孢的形成过程。这也很好的解释了结果与分析中2.2的结论。

图6 DPA含量的测定Fig.6 Determination of quantification of DPA

2.4 蒜汁浓度对B.subtilis芽孢发芽的影响

结果如表 1所示,将处理后的混合液取0.1 mL涂平板发现,活菌菌落数与对照相当,没有差异性。在芽孢发芽的120 min内,浓度高达10%的大蒜汁都对芽孢发芽没有显著性影响。

表1 蒜汁浓度、发芽时间对芽孢发芽的影响Table 1 The number of CFU at different germination time and concentrations of garlic juice

2.5 蒜汁处理B.subtilis的时间对其芽孢发芽的影响

结果如表2所示,在芽孢发芽的120 min内,处理时间长达120 min都对芽孢发芽没有任何影响,将处理后的混合液取0.1 mL涂平板发现,活菌菌落数与对照相当,没有差异性。

通过考察不同蒜汁浓度、不同发芽时间、不同抑制处理时间三个因素之间的二因素试验,发现这三个因素都对芽孢的发芽没有影响,试验结果与空白对照相比无显著性差异,说明大蒜汁并不影响芽孢的发芽。

表2 处理时间、发芽时间对芽孢发芽的影响Table 2 The number of CFU at different treatment time and germination time with concentration of garlic juice

3 结论与讨论

通过试验发现,大蒜汁对B.subtilis芽孢和DPA的形成有重要作用,其影响主要是延缓了芽孢的形成过程,且随着大蒜汁浓度的增加,对形成芽孢的影响也越大,其抑制芽孢形成的时间越长。大蒜汁对芽孢的发芽影响作用不大,反应时间长达2 h,浓度高达10%的大蒜汁对芽孢的发芽没有显著影响。这可能是由于大蒜所含有效成分的硫原子与细菌生长繁殖所必需的半胱氨酸分子中的巯基相结合而抑制其生长和繁殖,其作用机制是与影响半胱氨酸蛋白酶活性的几种酶如脱氢酶、硫氧还蛋白还原酶、RNA聚合酶等上面的巯基结合,抑制了其活性[9]。芽孢形成的过程中,特别是在芽孢衣层形成外衣时,芽孢中半胱氨酸显著增加。半胱氨酸是由谷胱苷肽在水解酶活性增强作用下水解而来的[10],这对芽孢外衣形成是必需的;由于合成半胱氨酸受阻,从而可能改变了细菌细胞乃至芽孢的通透性,导致细菌芽孢壁层结构的不完整,这也解释了大蒜汁对形成芽孢的影响试验;而芽孢发芽的过程非常短,热激活后芽孢衣中半胱氨酸已经变性,芽孢透性增加,开始自然裂解和下一代营养细胞的生长,此时加入大蒜汁处理2 h内,大蒜汁无作用效果。关于此现象原因并未在国内外报道中发现,有待于进一步研究。此外,大蒜对于芽孢的作用机理目前并无统一认识,也有待于进一步研究。

[1]何国庆,贾英民.食品微生物学 [M].北京:中国农业大学出版社,2002:303-304.

[2]吕嘉枥.食品微生物学 [M].北京:化学工业出版社,2007:197-208.

[3]Imamura D,Kobayashi K,Sekiguchi J,et al.spoIVH(ykv V),a requisite cortex formation gene,Is expressed in both sporulating compartments of bacillus subtilis[J].Journal of bacteriology,2004,186(16):5450-5459.

[4]杨文博.微生物学实验 [M].北京:化学工业出版社,2004:24-51.

[5]Abriouel H,M aqueda M,Galvez A,et al.Inhibition of bacterial growth,enterotoxin production,and spore outg rowth in strains of Bacillus cereus by bacteriocin AS-48[J].Applied and environmental microbiology,2002,68(3):1473-1477.

[6]Banerjee M,Sarkar PK.Inhibitory effect of garlic on bacterial pathogens from spices[J].World journal of microbiology,2003(19):565-569.

[7]病原微生物实验室污染物排放标准 (征求意见稿)[S].北京环保科学研究所,2006.

[8]高瑀珑,鞠兴荣,吴定.微热协同超高压处理杀灭芽孢杆菌芽孢效果的研究[J].食品科学,2007,28(3):59-63.

[9]Ankri S,Mirelman D.Antimicrobial properties of allicin from garlic[J].Microbes and infection,1999,1(2):125-129.

[10]Cheng HM,Aronson AI,Holt SC.Role of glutathione in the morphogenesis of the bacterial spore coat[J].Journal of bacteriology,1973,113(3):1134-1143.