体外培养癫痫细胞模型中整合素α2表达的变化☆

苏婕吴原吴月娟马美刚唐玉兰余璐刘云李佳荃

·论 著·

体外培养癫痫细胞模型中整合素α2表达的变化☆

苏婕*吴原*吴月娟*马美刚*唐玉兰*余璐*刘云*李佳荃△

目的 探讨体外培养癫痫细胞模型中整合素α2（integrin α2）的动态表达变化及意义。方法 体外培养至第7天的乳鼠海马神经元分成对照组和实验组，实验组利用“无镁细胞外液”体外培养3 h制备体外癫痫神经元细胞模型，免疫细胞化学法和逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）法测定对照组及实验组造模后12 h，24 h，48 h三个时间点的integrin α2蛋白及mRNA的相对表达变化。结果 造模24 h后神经网络迁移，呈 “网格样”改变；integrin α2蛋白相对表达：平均光密度值（mean integrated optical density，mean IOD）对照组为（0.033±0.005），实验组12 h（0.084±0.033），24 h（0.076± 0.018），48 h（0.077±0.006），实验组均高于对照组（P＜0.05），在造模后12-48 h表达量维持在两倍以上；RT-PCR结果示对照组integrin α2与β-actin光密度值（optical density，OD）之比为（0.316±0.039），实验组12 h（0.435±0.067），24 h（0.453±0.046），48 h（0.515±0.054），不同时间实验组与对照组相比，integrin α2 mRNA表达均显著提高（P＜0.05）。结论 Integrin α2在体外培养乳鼠海马癫痫神经元中表达增加，推测integrin α2可能参与了细胞持续自发性放电后神经网络的重组过程。

整合素α2 神经网络 无镁液 癫痫细胞模型

癫痫的发病机制尚未完全明确，目前神经网络学说正受到普遍关注［1］。研究证实，难治性癫痫患者中，一系列的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）分子表达呈上调趋势，并诱发齿状回苔藓纤维出芽，形成异常突触联系［2－3］。而整合素（integrins）是层粘连蛋白 （laminin）等ECM分子的主要受体之一，参与了多种正常细胞及肿瘤细胞的迁移过程［4］。Integrins是由α和β组成的异二聚体结构，integrin α2是α亚单位的亚型之一。本实验通过建立小鼠难治性癫痫细胞模型，并以正常体外培养的神经元为对照组，对integrin α2的蛋白和mRNA表达水平进行检测，探讨其与神经元异常网络形成的关系及在难治性癫痫发病机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选用出生24 h内的昆明小鼠，雌雄不限，由广西医科大学动物中心提供。

1.2 细胞模型制备

1.2.1 细胞培养 分离并剪碎双侧海马组织，0.125%胰酶37℃消化20 min。含血清培养液中止消化，轻柔吹打，细胞筛过滤，离心后弃上清，以5～7 ×105的密度接种在底部放有0.01%多聚赖氨酸包被过的盖玻片的6孔培养板中，2 mL／孔。37℃、5% CO2细胞培养箱内培养24 h后全量换为无血清培养液 （NEUROBASALTM-A Medium＋B27，Gibco）继续培养。第7天采用神经元特异性神经丝蛋白（Neurofilament-200，NF-200）多克隆抗体 （1∶500，Santa Cruz）对细胞进行鉴定及神经元纯度计算。

1.2.2 模型构建 分为对照组及实验组。参照Sambati法［5］，实验组第7天用无镁细胞外液培养3 h后恢复无血清培养液继续培养。无镁细胞外液（mmol／L）：NaCl 145、KCl 2.5、HEPES 10、CaCl22、glucose 10、glycine 0.002，pH 7.2。对照组全量换液一次。

1.3 Integrin α2蛋白表达检测 将对照组及实验组12 h，24 h，48 h细胞爬片取出采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法免疫染色，一抗为兔抗小鼠integrin α2多克隆抗体（1∶200，Santa Cruz），采用羊抗兔生物素化二抗（1∶200，北京中杉），随机图像采集，image pro plus6.0图像分析软件测量棕黄色阳性表达区的mean IOD。

1.4 Integrin α2 mRNA表达检测 提取对照组及实验组12 h，24 h，48 h细胞总RNA，逆转录后PCR：integrin α2，上游序列：5′-GGCTTTAATGATGT GATTGTCG-3′，下游序列：5′-GGGTTATCTTAGCA TCCTTGTTG-3′，产物长度：328 bp（上海生工）；内参β-actin上游序列：5′-ATCCACGAAACTACCTTC AA-3′，下游序列：5′-ATCCACACGGAGTACTTGC-3′，产物长度：200 bp（Invitrogen）。退火温度57℃30 s，循环数30。电泳后进行OD测定。

1.5 统计学方法 采用SPSS 13.0进行多组间统计分析，数据用x±s表示，采用完全随机设计的单因素方差分析检验，检验水准α＝0.05。

2 结果

2.1 细胞形态及神经元鉴定 神经元接种24 h后完全贴壁，部分长出短小突起。第7天，胞体增大、饱满，呈椭圆形或三角锥形，分布较均匀，表面光滑，折光性强，突起相互连接，交织成网络。无镁液处理3 h，神经元形态及神经网络光镜下均未见明显变化。恢复无血清培养液培养24 h，细胞迁移，神经网络出现“网格样”变化，随时间延长，部分神经元胞体相互聚集融合，神经网络的“网格”样变化更为明显（图1A，B）。

经NF免疫染色后，胞浆和突起染成棕色的细胞为神经元，神经元纯度接近90%（图2）。

图1 细胞形态。A：对照组分离培养7 d的海马神经元（200×）；B：实验组24 h的海马神经元（200×），细胞迁移，网络重组

图2 神经元鉴定NF-200免疫染色（200×）

2.2 Integrin α2蛋白表达的比较 各组细胞爬片中轴突与胞浆均有integrin α2的蛋白表达，以轴突部位的表达更为显著。与对照组相比，实验组各时间点蛋白表达显著增加，12 h即达到峰值，其后时间组一直维持在较高水平，差异有统计学意义（P＜0.05）（见表1及图3）。

表1 各组小鼠海马神经元integrin α2蛋白表达mean IOD值及mRNA表达

图3 神经元integrinα2蛋白表达 A：对照组（400×）；B：实验组12 h（400×）；C：实验组24 h（400×）；D：实验组48 h（400×）

2.3 Integrin α2 mRNA表达的比较 实验组各时间点与对照组相比integrin α2 mRNA表达均增加（P＜0.05），差异有统计学意义（P＜0.05），说明无镁液处理后神经元integrin α2 mRNA处于高表达水平（见表1及图4）。

图 4 各组小鼠海马神经元 integrin α2 mRNA电泳结果。M：Marker；1：对照组；2：实验组12 h；3：实验组24 h；4：实验组48 h

3 讨论

神经网络学说［1］认为，癫痫状态下，神经元异常放电诱使苔藓纤维出芽，神经网络的重组导致耐药性难治性癫痫的形成［6］。近期研究观察到匹罗卡品致痫大鼠海马微清蛋白中间神经元数目变化及轴突出芽［7］，反复惊厥阈下痫样放电也能导致海马齿状回颗粒细胞树突改变［8］。Integrins胞外区结合配体分子，胞内区与细胞骨架蛋白相连，将胞内外信号进行整合，在细胞黏附、增殖、分化、侵袭、迁移、凋亡等行为起着重要的调节作用［9］本研究构建癫痫细胞模型后不仅观察到神经元发生迁移，胞体聚集，神经网络出现“网格样”改变，而且检测出癫痫神经元细胞integrin α2蛋白及mRNA表达均增高，蛋白表达以轴突部位的改变最为显著。提示integrin α2可能参与了神经网络的重组行为。其表达增高的原因一方面可能由于ECM中integrin配体分子表达上调所致。有研究表明在人类难治性癫痫患者海马脑组织发现laminin表达增高［10］。laminin是ECM分子家族中integrin的配体分子之一，在病理状态下，由于长期自发性反复性放电导致累积性神经元损伤，反应性增生的胶质细胞及神经元可释放大量促进神经再生的因子如laminin等其他ECM分子，刺激神经细胞突起的生长，以修复损伤的部位［11］。因此当大量的配体分子结合到细胞表面时，不仅促使integrin受体分子聚集，也诱导细胞表达更多的受体分子以完成损伤的修复。另一方面神经元的凋亡也能促使integrin表达增高。机体中细胞团聚在一起，紧密黏附于ECM，形成行使功能和赖以生存的局部微环境。由于癫痫反复发作，细胞坏死及细胞外微环境发生改变，细胞脱离细胞黏附基质，失去细胞间联结，引起失巢性凋亡［12］。Integrin与配体结合后将诱导产生促进细胞生存的信号，增强细胞间及细胞与ECM的粘附，并同时促进细胞运动，转移细胞，防止失巢性凋亡的发生。若细胞所在微环境不含有相应的配体与之结合，integrin在胞浆内的尾部便会通过启动半胱天冬酶-8（caspase-8），诱使细胞发生凋亡［13］。所以癫痫状态下，laminin等ECM分子表达上调能达到间接抑制凋亡修复损伤的目的，可能为机体调控手段之一。

癫痫发病机制复杂，本研究在癫痫细胞模型中观察到神经元发生迁移并检测到integrin表达显著增高，提示其表达量的变化直接或间接的通过介导细胞粘附与迁移影响着神经网络的重组，并可能参与了神经细胞抗凋亡调控。研究integrin介导的信号转导途径也有利于开展integrin靶向药物的研究，阻断integrin介导的信号转导作用有望干扰神经元迁徙与生长，打破神经元网络重组，进而减缓控制了癫痫的发作。

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The expression of integrin α2 in the hippocampal neuronal culture model of epilepsy.

SU Jie， WU Yuan，WU Yuejuan，MA Meigang，TANG Yulan，YU Lu，LIU Yun，LI Jiaquan.Department of Neurology，the First Affiliated Hospital，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China.Tel：0771－15356735.

Object To investigate the expression of integrin α2 and explore its role in the hippocampal neuronal culture model of epilepsy.Methods The hippocampal neurons were isolated from 1-day mouse and cultured in vitro.On the 7th day，the neurons were divided into control group and experimental groups.In experimental groups， 3 h Mg2＋-free treatment was utilized to mimic status epilepticus injury in vitro.The immunohistochemical staining and RT-PCR were used to detect the protein and mRNA expression levels of integrinα2 in control and experimental groups.Results Neuronal cells migrated and formed“grid-like”network after Mg2＋-free treatment.The average optical densities（mean integrated optical density，mean IOD）of integrin α2 protein expression were 0.033±0.005 in control group and 0.084±0.033，0.076±0.018 and 0.077±0.006 at 12，24 and 48 h after Mg2＋-free treatment.The protein expression levels of integrin α2 in experimental groups were significantly higher compared with control groups（P＜0.05）.The protein expression levels of integrin α2 maintained twp folds of normal value during 12-48 h after Mg2＋-free treatment.RT-PCR showed that the ratio of optical densities of integrin α2 and β-actin was in control groups，0.316±0.039，0.435±0.067，0.453±0.046 and 0.515±0.054 at 12，24 and 48 h after Mg2＋-free treatment.Both of protein and mRNA expression levels of integrin α2 increased significantly in experimental groups at any point-in-time compared with the control group（P＜0.05）.Conclusions The integrin α2 expression increases in the hippocampal neuronal culture model of epilepsy， suggesting that integrin α2 may participate in epilepsy-induced network reorganization.

integrin α2 neural network Mg2＋-free Cculture model of epilepsy

R742.1

A

2010－11－20）

（责任编辑：李 立）

☆ 国家自然科学基金（编号：30960111）

* 广西医科大学第一附属医院神经内科 （南宁 530021）

（E-mail：wuyuan90＠126.com）

△ 广西医科大学实验中心