日循环高温对肉鸡组织锌离子浓度及金属硫蛋白含量的影响

吴 睿 张敏红 冯京海 郑姗姗

(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，动物营养学国家重点实验室，北京 100193)

日循环高温对肉鸡组织锌离子浓度及金属硫蛋白含量的影响

吴 睿 张敏红*冯京海 郑姗姗

(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，动物营养学国家重点实验室，北京 100193)

本文旨在研究日循环高温对肉鸡肝脏、胰腺及十二指肠锌离子浓度和金属硫蛋白含量的影响。选择32日龄爱拔益加(AA)肉用公鸡120只，随机分为3组(适温组、配对组和高温组)，每组4个重复，每个重复10只鸡。适温组及配对组维持恒温23℃，配对组按前1天高温组的采食量饲喂;高温组温度为23℃—33℃—23℃循环变化，自由饮水。结果显示，高温4和8 d可显著降低肉鸡血浆、肝脏、胰腺和十二指肠锌离子浓度(P＜0.05)，显著升高胰腺金属硫蛋白基因mRNA表达量(P＜0.05);高温4 d可显著降低肉鸡肝脏和十二指肠金属硫蛋白含量及其基因mRNA表达量(P＜0.05)，高温8 d均恢复至正常水平，但显著降低了肉鸡胰腺金属硫蛋白含量(P＜0.05);适温组与配对组锌离子浓度、金属硫蛋白含量及金属硫蛋白基因mRNA表达量差异不显著(P＞0.05)。本试验结果表明，日循环高温可导致肉鸡肝脏、胰腺及十二指肠锌离子浓度和金属硫蛋白含量下降，其下降与高温导致的肉鸡采食量下降无关，且肉鸡肝脏、胰腺及十二指肠中金属硫蛋白含量与锌离子浓度变化趋势相似。

高温;肉鸡;锌离子浓度;金属硫蛋白

环境温度升高所导致的应激作用可对肉鸡产生多方面的危害，如采食量下降［1-2］、饲料转化率降低［3］、消化道内壁毛细血管供血量下降［4］、下丘脑嗜食中枢受抑制［5］、肉品质下降［6］等，导致肉鸡生产性能降低，严重影响肉鸡生产的经济效益，给养殖业造成巨大的经济损失。锌是动物维持300多种酶活所必需的矿物质，参与动物机体许多酶解和代谢反应［7-9］，Bartlett等［10］报道高温会降低48日龄肉鸡血浆锌离子浓度;Sunder等［11］研究发现高温可导致28日龄肉鸡胫骨、肝脏及肾脏中锌离子浓度显著下降。金属硫蛋白(MT)是一种小分子量、半胱氨酸富集的金属结合蛋白，有广泛的生物学活性，如结合镉、汞等重金属［12-14］，调节锌离子吸收及代谢平衡［15-19］，缓解炎症反应［20-22］，抗氧化应激等［23-27］。大量研究表明MT能够被多种金属诱导，而锌是MT主要的生理诱导剂。锌能够缓解热应激对肉鸡的不利影响而MT又有抗应激作用，那么热应激对肉鸡锌和MT的影响又是怎样的呢?在热应激情况下锌与MT的关系又是怎样的呢?有关环境高温对肉鸡MT含量影响的研究未见报道，特别是此时锌离子浓度与MT含量关系的研究未见报道。本试验以肉鸡为研究对象，在人工环境气候控制舱内通过设定24 h的温度变化数据，并按照此规律昼夜循环来模拟夏季持续高温，研究日循环高温对肉鸡肝脏、胰腺及十二指肠锌离子浓度和MT含量的影响，为阐明热应激对肉鸡MT含量的影响及进一步研究热应激情况下锌对MT含量及其基因mRNA表达的影响提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验设计与饲养管理

选择1日龄健康爱拔益加(AA)肉用公鸡120只，随机分为3组，每组4个重复，每个重复10只鸡。试验鸡饲养在层叠式笼中，自由采食和饮水，24 h光照，饲粮为玉米-豆粕型饲粮。在32日龄时，将试验鸡转入人工环境控制舱内饲养。3个组分别为适温组(normal-temperature group，NTG)、配对组(paired-feeding group，PFG)和高温组(high-temperature group，HTG)，其中适温组昼夜维持恒温23℃，自由采食;配对组昼夜维持恒温23℃，试验第1天自由采食，并统计第1天高温组的采食量，从第2天开始配对组的饲料投喂量与前1天高温组的采食量相同;高温组温度以23℃—33℃—23℃循环变化，相对湿度为(50±5)%，24 h昼夜温度变化规律为02:00—07:00由23℃匀速升至33℃，07:00—09:00维持33℃恒温，09:00—14:00由33℃匀速降至23℃，14:00至第2天02:00维持23℃恒温，自由采食饮水。肉鸡在气候舱内适应3 d后开始正式试验，试验期为8 d。饲养管理按AA肉仔鸡饲养管理手册进行。饲粮参照NRC(1994)肉鸡饲养标准配制。基础饲粮组成及营养水平见表1。试验开始前对饲粮随机采样2 kg左右，并用四分法取出约250 g，用国标 GB/T 13885—2003推荐的原子吸收光谱法测定饲粮中锌含量为90.49 mg/kg。

1.2 样品采集与制备

正式试验开始的前1天(日循环高温处理0 d)、试验第4天(日循环高温处理4 d)、试验第8天(日循环高温处理8 d)，每重复随机选择1只鸡，翅静脉采集抗凝血10 m L左右，3 000 r/m in离心10 m in，分离血浆，-20℃保存待测血浆指标;采血后将肉鸡颈部放血，剥皮，快速解剖分离肝脏、胰腺及十二指肠，各组织分别取1和3 g左右，投入液氮速冻后于-80℃保存待测。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 直肠温度和呼吸率

分别在试验正式开始前1天、试验第4天、试验第8天的09:00每个重复随机取2只鸡，使用电子温度计测定直肠温度，探头插入直肠的深度为3 cm。同时用秒表计时，计数器计数的方式测定肉鸡1 m in内的呼吸次数。

表1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础)Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets(DM basis) %

1.3.2 血浆及组织锌离子浓度

将采集的肉鸡血浆及组织用硝酸-高氯酸进行湿法消化［28］，冷却定容后用原子吸收分光光度计测定血浆及组织消化液中锌离子浓度［29］。测定用硝酸及高氯酸均为优级纯，所使用玻璃器皿提前用5%硝酸浸泡以去除离子干扰。

1.3.3 组织MT含量

用银离子饱和法［30］测定肝脏、胰腺及十二指肠中MT含量，测定用牛血红蛋白购自Sigma公司，银离子标准液由中国计量科学院提供，使用仪器为SOLAAR M 6型原子吸收光谱仪。

1.3.4 MT 基因 mRNA 表达量

将采集的肉鸡组织在低温无污染条件下提取RNA，并反转录为cDNA，用实时荧光定量PCR(real-time PCR)法对肉鸡组织内MT基因mRNA的相对表达量进行测定。所用仪器为美国AB公司的7500型荧光定量PCR仪，采用2-△△Ct法进行数据的相对定量分析，以β-actin作为内参基因，上游引物序列为:3'-CTCCTGCTCCTGTGCTGGGTCGTGC-5'，下游引物序列为:3'-CGGTTCCTTGCAGACACAGCCCTT-5'。

1.4 数据统计与分析

采用 SAS 8.1软件对数据进行分析，并用ANOVA程序进行单因素方差分析，用Duncan氏法进行差异显著性检验。试验数据以平均值±标准差表示，差异显著性水平为P＜0.05。

2 结果

2.1 呼吸率和直肠温度

由表2可知，在高温前(日循环高温处理0 d)，3个试验组肉鸡的呼吸率和直肠温度均处于同一水平，各组间差异不显著(P＞0.05);日循环高温处理4和8 d后，高温组肉鸡的呼吸率和直肠温度均显著高于适温组(P＜0.05)，而配对组与适温组均无显著差异(P＞0.05)。

表2 日循环高温对肉鸡呼吸率和直肠温度的影响Table 2 Effect of cyclic high temperatures on the respiratory rate(RR)and rectal temperature(RT)of broiler chickens

2.2 血浆及组织锌离子浓度

由表3可知，在高温前，3个试验组肉鸡的血浆及各组织锌离子浓度均处于同一水平，各组间差异不显著(P＞0.05);日循环高温处理4和8 d后，高温组肉鸡的血浆、肝脏、胰腺及十二指肠锌离子浓度与适温组相比均显著下降(P＜0.05)，配对组与适温组均无显著差异(P＞0.05)。

2.3 组织M T含量

由表4可知，3个试验组肉鸡在高温前组织MT含量均处于同一水平，各组间差异不显著(P＞0.05);日循环高温处理4 d后，高温组肉鸡肝脏和十二指肠MT含量与适温组相比显著下降(P＜0.05)，胰腺MT含量与适温组无显著差异(P＞0.05);日循环高温处理8 d后，肉鸡胰腺MT含量与适温组相比显著下降(P＜0.05)，配对组与适温组均无显著差异(P＞0.05)。

2.4 M T基因m RNA表达量

由表5可知，3个试验组肉鸡在高温前MT基因mRNA表达量均处于同一水平，各组间差异不显著(P＞0.05);日循环高温处理4和8 d后，高温组肉鸡胰腺MT基因mRNA表达量与适温组相比显著升高(P＜0.05);日循环高温处理4 d后，肉鸡肝脏及十二指肠MT基因mRNA表达量与适温组相比显著下降(P＜0.05)，配对组与适温组均无显著差异(P＞0.05)。

3 讨论

肉鸡没有汗腺又被覆羽毛，因此对环境温度的调节能力较差。一般成年肉鸡的饲养适宜温度为21～25℃。在本试验中日循环高温处理温度为33℃—23℃—33℃，可导致肉鸡直肠温度和呼吸率显著升高，说明此试验条件可以使肉鸡产生热应激。

锌参与动物机体内许多酶解和代谢反应，大量有关锌对热应激影响的研究被报道。Sahin等［31-32］进行的有关补锌对热应激鹌鹑的研究表明，在每千克基础饲粮中补充30或60 mg硫酸锌可以提高热应激情况下蛋用鹌鹑的饲料效率、产蛋量及蛋品质;提高肉用热应激鹌鹑的生产性能和屠体重。也有报道，每千克基础饲粮中补充80［33］或 100 mg［34］的蛋氨酸锌能够提高热应激蛋鸡的蛋重，减少蛋鸡破蛋率。本试验从不同高温时间、肉鸡的不同器官着手进一步探讨了高温对锌离子浓度的影响，得出日循环高温处理4和8 d高温组肉鸡血浆、肝脏、胰腺及十二指肠中锌离子浓度与适温组及对照组相比均显著下降，此结果与Sahin等［35］的报道相一致。由于适温组与配对组除采食量不同，其他试验条件均一致，而配对组的采食量由高温组决定，适温组与配对组锌离子水平无显著差异即采食量的变化不会导致各组间试验指标显著差异。说明高温组肉鸡肝脏、胰腺及十二指肠锌离子含量的下降与高温导致肉鸡采食量下降无关。

MTs是属于胞内金属结合蛋白的一种，有着广泛的生物学特性。一些研究表明，高温能够影响动物MT的含量，但结论并不一致。Ding等［36］研究发现严重烧伤后小鼠肝脏MT含量增加;Liberge等［37］在对甲壳纲桡足亚纲动物的研究中发现热应激没有诱导MT的合成。但有关热应激对肉鸡MT含量影响的研究未见报道。本试验结果表明，日循环高温处理4 d高温组肉鸡肝脏和十二指肠MT含量与适温组相比显著下降;随着日循环高温时间延长至8 d，高温组肉鸡胰腺的MT含量与适温组相比显著下降，而适温组与配对组均无显著差异，说明高温组MT的下降与热应激导致采食量下降无关。虽然胰腺和肝脏及十二指肠MT含量下降的时间点不同，但热应激都导致了肉鸡肝脏、胰腺及十二指肠MT含量显著下降，这与热应激时锌离子浓度的变化趋势相同。因此可以推测热应激条件下MT发挥生理功能与锌离子浓度有关，但具体的作用机制仍需深入研究。

为了进一步探讨引起MT变化的原因，一些有关MT基因mRNA表达量的研究被报道。Tamai等［38］研究发现在热应激时酵母中的MT基因mRNA可以被激活并转录。Ding等［36］报道在严重烧伤3 h后小鼠肝脏MT基因mRNA表达量开始升高，在24 h时达到最高点。本试验对肉鸡肝脏、胰腺及十二指肠MT基因mRNA表达量的测定结果显示，日循环高温处理4 d导致高温组肉鸡肝脏和十二指肠MT基因mRNA表达量与适温组相比均显著下降，胰腺MT基因mRNA表达量与适温组相比显著升高，适温组与配对组MT基因mRNA表达量无显著差异，说明肉鸡MT基因mRNA变化与高温导致采食量下降无关。肉鸡肝脏、胰腺及十二指肠MT基因mRNA表达量变化规律与其MT含量变化规律并不完全一致，胰腺MT基因mRNA表达量虽然升高，但MT蛋白合成并没有增加，这也说明MT的翻译在一定程度上需要锌离子的参与，但导致这样结果的原因仍需进一步研究。

4 结论

①日循环高温可显著降低肉鸡血浆锌离子浓度，显著降低肉鸡肝脏、胰腺及十二指肠锌离子浓度和MT含量，且锌离子浓度和MT含量的下降不是由热应激导致的肉鸡采食量下降引起的。

②肉鸡肝脏、胰腺及十二指肠中MT含量与锌离子浓度呈现相同的变化趋势。

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*Corresponding author，professor，E-mail:zmh66@126.com

(编辑 何丽霞)

Effect of Cyclic H igh Tem peratures on the Zn2+Concentration and Metallothionein Content in Tissues of Broilers

WU Rui ZHANG Minhong*FENG Jinghai ZHENG Shanshan
(State Key Laboratory of Animal Nutrition，Institute of Animal Sciences，The Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing100193，China)

The experimentwas conducted to investigate the effect of cyclic high temperatures on the Zn2+concentration and metallothionein content in pancreas，liver and duodenum of broiler chickens.One hundred and twenty 32-day-old Arbor Acresmale broilers were random ly allotted to 3 groups(normal-temperature group，paired-feeding group and high-temperature group)with 4 replicates in each group and 10 birds in each replicate.The broilers in the normal-temperature group and paired-feeding group were maintained in a controlled environment temperature at 23℃，and the paired-feeding group were matched the diet intake of broilers in high-temperature group at the previous day of the experiment.The broilers in the high-temperature group were housed in a controlled environment temperature with daily cyclic high temperature(23℃ -33℃ -23℃)，and drinkedad libitum.The results showed as follow s:after 4 and 8 d cyclic high temperatures，the Zn2+concentration in plasma，liver，pancreas and duodenum of broilers was significantly decreased(P＜ 0.05)，and themRNA expression level ofmetallothionein gene in pancreaswas significantly increased(P＜0.05).After 4 d cyclic high temperatures，themetallothionein contentand itsmRNA expression level in liver and duodenum of broilers were significantly decreased(P＜0.05)，after 8 d cyclic high temperatures，they became the normol levels，but themetallothionein content in pancreas was significantly decreased(P＜0.05);there was no significant differences in the Zn2+concentration andmetallothionein content，and themRNA expression level of metallothionein gene between the normal-temperature group and paired-feeding group(P＞0.05).In conclusion，cyclic high temperatures significantly decreases the Zn2+concentration and metallothionein content in liver，pancreas and duodenum of broilers，which is independentof the decreasing of food intake induced by cyclic high temperatures，and the changing trend ofmetallothionein content is sim ilarwith thatof zinc concentration in liver，pancreas and duodenum of broilers.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2011，23(8):1273-1279］

cyclic high temperatures;broiler;Zn2+;metallothionein

S815.5

A

1006-267X(2011)08-1273-07

10.3969/j.issn.1006-267x.2011.08.004

2011-03-14

动物营养学国家重点实验室项目(2004DA125184G0807)

吴 睿(1984—)，女，黑龙江佳木斯人，硕士研究生，从事家禽营养调控的研究。E-mail:wurui840330@sina.com

*通讯作者:张敏红，研究员，博士生导师，E-mail:zmh66@126.com