精氨酸对免疫应激仔猪肠道组织Toll样受体基因表达的影响

陈 渝 陈代文 毛湘冰 毛 倩 齐莎日娜 余 冰

(四川农业大学动物营养研究所，动物抗病营养四川省重点实验室，雅安 625014)

精氨酸对免疫应激仔猪肠道组织Toll样受体基因表达的影响

陈 渝 陈代文 毛湘冰 毛 倩 齐莎日娜 余 冰*

(四川农业大学动物营养研究所，动物抗病营养四川省重点实验室，雅安 625014)

本试验旨在考察饲粮添加精氨酸(arginine，Arg)对免疫应激仔猪生长性能和肠道组织细胞膜外Toll样受体(TLR2、TLR4、TLR5、TLR6)基因表达的影响。选用(24±1)日龄的断奶、平均体重(7.19±0.63)kg的杜洛克×长白×大白公猪20头，随机分为4个处理，分别为饲喂基础饲粮+注射生理盐水(对照组)、饲喂基础饲粮 +注射沙门氏杆菌活疫苗(S.C500)(S.C500组)、饲喂基础饲粮添加0.5%Arg+注射S.C500(0.5%A rg组)和饲喂基础饲粮添加1.0%Arg+注射S.C500(1.0%Arg组)，每个处理5个重复，每个重复1头仔猪。应激处理于第8天实施，肌肉注射S.C500 4 m L。试验期17 d。第8(免疫应激前)、9、11、18天采集血样测定血清沙门氏菌抗体水平和IL-6浓度，第18天仔猪屠宰采集空肠和回肠组织样品，测定Toll样受体mRNA表达量。结果表明:与对照组相比，仔猪肌肉注射S.C500不同程度地降低了平均日增重(ADG)(P＜0.10)和平均日采食量(ADFI)(P＜0.05)，显著增加了在第9、11和18天血清IL-6浓度(P＜0.05)，同时显著上调了空肠和回肠组织中TLR4和TLR5 mRNA表达量(P＜0.05);添加Arg(0.5%和1.0%)能够缓减疫苗注射导致的以上抑制的效应，显著抑制了仔猪血清IL-6浓度、空肠和回肠TLR4和TLR5 mRNA表达量的上调(P＜0.05)。结果提示，饲粮添加Arg能显著减缓因S.C500注射引起的断奶仔猪肠道TLR4和TLR5基因的过度表达、血清IL-6浓度的升高，从而缓解免疫应激对仔猪的损伤。

精氨酸;断奶仔猪;免疫应激;Toll样受体

每年因疾病导致的猪只死亡不计其数，经济损失巨大。随着饲用促生长抗生素因其对人类健康的危害而渐渐被禁用后，在饲粮中添加营养素来调控猪只自身的免疫力无疑成为了抵抗疾病的重要途径之一［1］。精氨酸(arginine，Arg)是断奶仔猪的必需氨基酸，饲粮中含有充足的Arg才能保证仔猪健康生长［2－4］。仔猪体内Arg的降解主要发生在小肠，由精氨酸酶和一氧化氮合酶(NOS)将其分解为瓜氨酸、鸟氨酸、尿素和一氧化氮(NO)［5］。大量动物和人类试验均表明，Arg作为一种重要的免疫调节剂［6－7］，可通过促进胰岛素、生长激素、类胰岛素生长因子、白细胞介素－1(interleukin-1，IL-1)、白细胞介素 －12(interleukin-12，IL-12)、肿瘤坏死因子 － α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和 γ － 干扰素(interferon-γ，IFN-γ)等内分泌激素的分泌而介导对机体免疫功能的调节［8］。饲粮添加Arg能增强各种免疫应激下动物的免疫功能［9－12］，从而降低因病原感染引起的动物发病和死亡。

细胞膜外 Toll样受体(toll-like receptors，TLRs)，主 要 包 括 TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6，是一类动物体内模式识别受体(pattern rec-ognition receptor，PRR)，通过识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)介导天然免疫［13］。细胞膜外TLRs主要通过识别细菌的毒力成分并与之相结合，然后将该信号最终传递给核转录因子κB(NF-κB)或丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)，从而产生 TNF-α、IL-1、白细胞介素 －6(interleukin-6，IL-6)、IL-12 和 IFN-γ 等细胞因子来参与免疫调节［14］。当细菌入侵动物机体时，细菌特有成分［如鞭毛、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)］刺激细胞膜外 TLRs(如 TLR4、TLR5)使得其mRNA水平上调［15－16］，同时伴随着诱导性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的 mRNA 水平上调［17］，iNOS 的功能是合成NO，这说明动物机体在应激情况下需要NO来参与机体功能的调节。Arg作为动物体内iNOS合成NO的唯一底物，并且在免疫功能上与TLRs调节着相同细胞因子，那么A rg是否与Toll受体介导的天然免疫存在密切联系?因此，本试验采用断奶仔猪注射沙门氏菌疫苗建立免疫应激模型，初步探讨Arg与仔猪肠道细胞膜外TLRs基因表达的关系，为Arg的合理利用及寻求改善仔猪免疫能力的营养措施提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

沙门氏菌活疫苗(S.C500)购于山东绿都生物科技有限公司。

1.2 试验动物及设计

试验选用(24±1)日龄的断奶、平均体重(7.19±0.63)kg的杜洛克×长白×大白去势公猪20头，随机分为4个处理，分别饲喂基础饲粮+注射生理盐水(对照组)、基础饲粮+注射S.C500(S.C500组)、基础饲粮 +0.5%Arg+注射S.C500(0.5%Arg 组)和基础饲粮 +1.0%Arg+注射S.C500(1.0%Arg组)，每个处理 5个重复，每个重复1头仔猪。试验期17 d。

1.3 试验饲粮

基础饲粮参照NRC(1998)进行配制。基础饲粮组成及营养水平见表1。0.5%和1.0%Arg组分别以0.5%和1.0%的Arg等量替代基础饲粮中的玉米。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.4 饲养管理

1.5 样品采集

于试验第8(疫苗注射前)、9、11、18天，全部仔猪空腹前腔静脉采血10 m L，收集于离心管中，3 000 r/min离心15min，收集血清，－20℃冰箱保存。

第18天采血后，所有仔猪麻醉致死，迅速取出空肠和回肠，分别剪取整个肠道组织中段，并将样品用液氮速冻后转入－80℃冰箱保存。

1.6 测定指标及方法

1.6.1 生长性能

平均日采食量(ADFI):试验期间记录每头猪每天饲喂量，计算ADFI。

平均日增重(ADG):试验期第8、18天称量仔猪空腹体重，计算ADG。

料重比(F/G):由ADFI和ADG之比得出。

1.6.2 血清沙门氏菌抗体

采用HerdChek猪沙门氏菌抗体检测试剂盒(购于爱德士生物科技股份有限公司)检测第8、9、11、18天的血清沙门氏菌抗体水平，具体操作按试剂盒说明书进行，结果以吸光度百分比表示。

Thermodynamic Analysis of Supercritical Working Fluid Brayton Cycle ZHENG Kaiyun(42)

1.6.3 血清IL-6浓度

第8、9、11、18天血清中IL-6浓度采用猪 IL-6 ELISA试剂盒(R＆D，美国)进行测定。具体操作按试剂盒说明书进行。

1.6.4 肠道TLRsmRNA表达量

空肠和回肠肠道片段组织总RNA提取按照Trizol试剂(TaKaRa，日本)说明书进行，提取的总RNA最后溶解于无RNA酶水(RNase Free dH2O，TaKaRa，日本)中。琼脂糖凝胶电泳检查RNA的完整性。核酸蛋白质检测仪(Beckman Du－800，CA，美国)于260 nm波长处检测RNA浓度。cDNA合成采用逆转录试剂盒(PrimeScriptTMreagent kit，TaKaRa，日本);反应体系 10 μL:2 μL 5 ×PrimeScriptTMBuffer，0.5 μL PrimeScriptTMRT Enzyme Mix，0.5 μL Oligo dT Primer，0.5 μL Random 6 mers，4.5 μL RNase Free dH2O，2 μL Total RNA。反转录反应参数:37℃、15 m in;85℃、5 s。反应结束后－20℃保存备用。

实时荧光定量PCR(real-time PCR)法测定空肠和回肠肠道组织中 TLR2、TLR4、TLR5、TLR6 mRNA表达量。用CFX-96 real-time PCR System(Bio-Rad，美国)进行测定，反应荧光染料为SYBRGreenⅠ(TaKaRa，日本)。反应体系为10μL:5 μL SYBR Prem ix Ex TaqTMⅡ(2×)，1μL上游引物，1μL下游引物，2μL dH2O，1μL cDNA模板。利用NCBI搜索目的基因片段，运用Primer 5、Oligo 6.0软件进行引物设计，送交大连宝生物公司合成，引物序列及参数见表2。反应程序:95℃预变性10 s;95℃变性5 s;退火温度下(表2)退火25 s;40个循环。用于检测基因扩增产物特异性的熔解曲线反应程序为:95℃、10 s;65℃、25 s;95℃、0 s(温度变化速率为0.1℃ /s)。实时荧光定量测定方法参照文献［18］，采用双ΔCt+标准曲线扩增效率校正法，标准曲线采用10倍梯度稀释法制作，每个样品3个重复，内参基因选用β－肌动蛋白(β-actin)。

1.7 数据处理和统计分析

基因表达结果采用相对表达量的形式，以β-actin为内参基因进行计算，具体方法参照文献［18］。所有数据采用SAS 8.1单因素方差分析并进行Duncan氏多重比较。结果以平均值±标准误表示，以P＜0.05为差异显著标准。

2 结果

2.1 饲粮添加Arg对免疫应激仔猪生长性能的影响

由表3可知，试验期1～7 d，各组试猪ADFI、ADG和F/G差异不显著(P＞0.05);在肌肉注射S.C500后，8～17 d与对照组相比，S.C500组仔猪 ADG 和 ADFI分别降低 14.5%(P＜0.10)、23.5%(P＜0.05)，添加 Arg(0.5% 和 1.0%)能够缓减疫苗注射导致的以上抑制的效应，其中0.5%Arg组仔猪 ADG 比S.C500组提高6.0%，F/G 无显著差异(P＞0.05)。

2.2 饲粮添加Arg对免疫应激仔猪血清沙门氏菌抗体的影响

由表4可知，试验第8天(注射S.C500前)，仔猪体内沙门氏菌血清抗体处于一个极低水平(与注射疫苗后比)，各组之间无显著差异(P＞0.05)。在注射S.C500后的3和10 d(试验第11和18天)，S.C500组抗体水平显著高于其他各组(P＜0.05)。0.5%Arg组在试验第18 天和1.0%Arg组在试验第11和18天的血清沙门氏菌抗体水平显著高于对照组(P＜0.05)，显著低于同时期S.C500组的血清抗体水平(P＜0.05)。

表2 实时荧光定量PCR引物序列及参数Table 2 Primer sequences and parameters for real-time PCR

表3 精氨酸对免疫应激仔猪生长性能的影响Table 3 Effect of arginine supplementation on growth performance of weaned piglets under immune stress

表4 精氨酸对免疫应激仔猪血清沙门氏菌抗体含量的影响Table 4 Effect of arginine supplementation on antibody content of Salmonella in serum of weaned piglets under immune stress %

2.3 饲粮添加Arg对免疫应激仔猪血清IL-6的影响

由表5可知，试验第8天(注射S.C500前)，各组仔猪血清IL-6浓度无显著差异(P＞0.05)，Arg对IL-6浓度无显著影响(P＞0.05)。注射S.C500后，试验第9和11天，S.C500组较对照组仔猪体内IL-6浓度又显著上升(P＜0.05)，而0.5%Arg组和1.0%A rg组血清 IL-6浓度均显著低于S.C500组(P＜0.05)，与对照组无显著差异(P＞0.05)。试验第18天，S.C500组血清IL-6浓度显著高于其他各组(P＜0.05)，且0.5%Arg组血清IL-6浓度显著低于对照组(P＜0.05)。

表5 精氨酸对免疫应激仔猪血清IL-6浓度的影响Table 5 Effect of arginine supplementation on serum IL-6 concentration of weaned piglets under immune stress ng/m L

2.4 饲粮添加A rg对免疫应激仔猪肠道TLR2、TLR4、TLR5和TLR6 m RNA表达量的影响

由图1可见，注射S.C500后免疫应激和A rg添加对仔猪空肠TLR2和TLR6 mRNA相对表达量无显著影响(P＞0.05)。注射S.C500后，S.C500组空肠TLR4和TLR5 mRNA相对表达量显著上调(P＜0.05)，而添加Arg能显著降低因S.C500注射导致的TLR4和TLR5 mRNA相对表达量的上调，其相对表达量与对照组无显著差异(P＞0.05)。

图1 仔猪空肠TLR2、TLR4、TLR5和TLR6 m RNA相对表达量Fig.1 Relative expression levels of TLR2，TLR4，TLR5，TLR6 mRNA in jejunum of weaned piglets

由图2可见，注射S.C500后，免疫应激和Arg添加对仔猪回肠TLR2和TLR6 mRNA相对表达量无显著影响(P＞0.05)。注射S.C500后，S.C500组回肠TLR4和TLR5 mRNA相对表达量均显著上调(P＜0.05)，但添加A rg能显著降低因注射S.C500导致的TLR4和TLR5 mRNA相对表达量的上调(P＜0.05)。另外，0.5%A rg组和1.0%Arg组回肠TLR4 mRNA相对表达量均显著高于对照组(P＜0.05)，显著低于S.C500组(P＜0.05)，而TLR5 mRNA相对表达量则与对照组差异不显著(P＞0.05)。

图2 仔猪回肠TLR2、TLR4、TLR5和TLR6 m RNA相对表达量Fig.2 Relative expression levels of TLR2，TLR4，TLR5 and TLR6 mRNA in ileum of weaned piglets

3 讨论

本试验根据预试验结果(仔猪的临床表现、抗体和炎性细胞因子的产生情况)确定了沙门氏菌活疫苗(S.C500)的注射剂量为4 m L(推荐免疫剂量的4倍)。沙门氏菌的主要毒力因子是O抗原(LPS)和 H抗原(菌鞭毛)［19］，这些抗原能够诱导动物机体产生炎症反应，分泌大量的炎性因子［13，20］。而本试验仔猪血清抗体、IL-6 浓度等的变化也证明了该剂量的沙门氏菌疫苗能诱导仔猪产生显著的免疫应激。

Toll样受体家族是一类介导天然免疫的模式识别受体家族，根据其处于细胞内的位置不同分为细胞膜外和细胞膜内Toll样受体［14］，细胞膜外TLRs主 要 包 括 TLR1、TLR2、TLR4、TLR5 和TLR6，它们通过自身形成同源二聚体或者与其他Toll样受体形成异源二聚体，如 TLR1-TLR2、TLR2-TLR6、TLR4-TLR5［21］，用于细菌的特异性成分的识别，将该信号最终传递给 NF-κB或MAPK，从 而 产 生 TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12 和IFN-γ等细胞因子参与免疫调节［14］。但是这些细胞膜外TLRs被过度激活后也会伤害到动物自身，迫使机体产生炎性反应给动物机体带来负面影响［22－23］。由本试验结果可知，注射S.C500 后，仔猪 ADFI下降、空肠和回肠组织中 TLR4和TLR5 mRNA表达量显著上调，表明4 m L沙门氏菌活疫苗使得仔猪产生了应激反应;也说明肠道TLR4和TLR5已经过度活化，而过度活化的Toll受体会诱导炎性因子大量产生［14，22－23］，产生炎性反应，这也可能是仔猪表现出现ADG和ADFI下降的重要原因。IL-6是细胞膜外TLRs受体被激活后会产生的一种细胞因子，是一种促炎递质，大量产生会加剧体内炎性反应，甚至导致一些疾病的恶化［24－25］。本试验发现，S.C500 应激后，仔猪血清IL-6浓度显著增加。

饲粮添加Arg缓解了仔猪因沙门氏菌活疫苗注射导致的采食量下降，下调了肠道TLR4和TLR5的过度表达，降低了血液IL-6水平。说明Arg能够以某种途径影响肠道TLR4和TLR5的表达，进而缓减IL-6等炎性因子的生成。前人也有研究发现，在含1.2%左右Arg的基础饲粮中额外添加0.5%和1.0%Arg能够缓解由应激导致的仔猪肠道损害［26－27］。Arg是通过何种途径下调应激仔猪空肠和回肠组织中TLR4和TLR5基因的过度表达?研究发现，Arg主要在动物的小肠中进行分解代谢，在精氨酸酶和NOS的作用下转化为鸟氨酸、瓜氨酸、尿素和 NO，且 Arg是 NOS分解产生NO的唯一底物［5］。在LPS致大鼠急性肺损伤的试验中发现，让大鼠吸入不同浓度的NO后，TLR4 mRNA相对表达量极显著下调［28］。另外，在外界微生物刺激下，人鼻腔黏膜中TLR4 mRNA表达量显著增加，同时iNOS mRNA也显著上调［29］。而 K leeberger 等［17］、Rodriguez 等［30］、Forst等［31］均发现应激状态下的小鼠体内TLRs与iNOSmRNA表达呈正相关的关系。所以在TLRs的基因过度表达时候，伴随着iNOS也同时大量表达，iNOS是NOS的一种，其功能是催化Arg分解生成NO，在机体受到某些应激刺激(如LPS应激)的时候才会大量表达［32］。因此，可以推测本试验中Arg对应激状态下空肠和回肠组织Toll样受体过度表达的下调，可能与其降解为NO进而发挥作用有关。但是，具体途径有待进一步研究。

另外，本试验中仔猪空肠和回肠组织TLR2和TLR6在免疫应激后mRNA表达量变化不明显，可能的原因是TLR2和TLR6识别的配体主要是细菌的脂肽［14］，而本试验所用沙门氏菌活疫苗的毒力因子主要是LPS和鞭毛，因此未能激活TLR2和TLR6。

4 结论

饲粮添加Arg能显著减缓因S.C500注射引起的断奶仔猪肠道TLR4和TLR5基因的过度表达、血清IL-6浓度的升高，从而缓解免疫应激对仔猪的损伤。

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*Corresponding author，associate professor，E-mail:ybingtian@yahoo.com.cn

(编辑 王智航)

Effect of Arginine Supp lem entation on Genes Expression of Toll-like Receptors in Intestinal Tissues of Weaned Piglets under Imm une Stress

CHEN Yu CHEN Daiwen MAO Xiangbing MAO Qian QISharina YU Bing*
(Institute of Animal Nutrition，Sichuan Agricultural University，Animal Disease-resistance Nutrition Key Laboratory of Sichuan Province，Ya’an625014，China)

This trialwas conducted to study the effect of arginine(A rg)supplementation on growth performance and genes expression of cell-surface toll-like receptors(TLR2，TLR4，TLR5 and TLR6)in intestinal tissues of weaned piglets under immune stress.Twenty male weaned piglets［(Duroc×Landrace×Yorkshire)，(24 ±1)days of age，average body weight of(7.19 ±0.63)kg］were random ly assigned to 4 treatments with 5 replicates in each treatment and 1 piglet per replicate.Pigletswere fed basal diet+injected sterile saline(control group)，fed basal diet+injected live vaccine ofSalmonella choleraesuis500(S.C500)(S.C500 group)，fed basal diet supplemented with 0.5%Arg+injectedS.C500(0.5%A rg group)，and fed basal diet supplemented with 1.0%Arg+injectedS.C500(1.0%Arg group)，respectively.The injection of 4 m LS.C500 or sterile salinewas carried out on day 8.The trial lasted for 17 d.Blood sampleswere collected to determ ine serumSalmonellaantibody level and interleukin-6(IL-6)concentration on day 8(before injection)，day 9，day 11 and day 18.Piglets were slaughtered and jejunum and ileum tissue sampleswere collected for evaluation of mRNA expression levels of toll-like receptors on day 18.The results showed as follows:compared with the control group，injection ofS.C500 decreased the ADG(P＜0.10)and ADFI(P＜0.05)of piglets to a different extent，significantly increased serum IL-6 concentration on day 9，day 11 and day 18(P＜0.05)，aswell asmRNA expression levels of TLR4 and TLR5 in jejunum and ileum tissue(P＜0.05);Arg supplementation(0.5%and 1.0%)alleviated inhibitive effects induced byS.C500 challenge，decreased serum IL-6 concentration，and inhibited mRNA expression levels of TLR4 and TLR5 in jejunum and ileum tissue(P＜0.05).These results indicate that Arg supplementation can alleviate the over-expression of TLR4 and TLR5 mRNA in intestinal tissues and the excessive production of serum IL-6 induced byS.C500 challenge，which are beneficial to alleviating damage induced by immune stress.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2011，23(9):1527-1535］

arginine;weaned piglet;immune stress;toll-like receptor

S828

A

1006-267X(2011)09-1527-09

10.3969/j.issn.1006-267x.2011.09.011

2011－04－07

国家自然科学基金项目(30800787)

陈 渝(1985—)，男，重庆万州人，硕士研究生，从事动物营养和饲料科学的研究。E-mail:g4hitboy@qq.com

*通讯作者:余 冰，副教授，硕士生导师，E-mail:ybingtian@yahoo.com.cn