实时荧光定量PCR在植物害虫研究中的应用

郭庆，王忠跃，孔繁芳，武艳霞

（中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193）

1983年美国PE Cetus公司人类遗传研究室的Kary Mullis发明了聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）[1]，该体外核酸扩增技术具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点，被广泛应用于基础研究，成为分子生物学、鉴别遗传疾病和快速检测病毒和病菌感染必不可少的研究工具。1992年日本人Higuchi想实时观察PCR反应的全过程，最终达到检测样品中的DNA量的目的，最早提出了实时荧光定量PCR的设想[2,3]，继而由1996年美国Applied Biosystems公司首先推出实时荧光定量PCR技术。由于传统的PCR技术都是依赖于产物的终点浓度进行分析的，存在不能准确定量，且操作过程中易污染而使得假阳性率高等缺点，使其应用受到局限，直到近年来荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer,FRET）技术用于PCR定量后，上述问题才得到较好的解决[4]，随着实时荧光定量PCR的发明，此技术在不同研究领域都发挥出重要作用[5～8]。

实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，FQ-PCR）是在常规PCR技术基础上把荧光共振能量转移与荧光标记探针相结合，并巧妙地把核酸扩增、杂交、光谱分析和实时检测技术融合在一起的一项创造性技术，该技术不仅实现了对DNA模板的定量，它具有实时性、快速、灵敏、高通量、特异性强、自动化程度高、重复性好、准确定量等特点。

近年来，实时荧光定量PCR技术不断完善，取得了突飞猛进的发展。由于该技术本身的优越性，被广泛应用于医疗检测、药物疗效考核、基因表达研究、转基因研究、基因检测、病原体检测、动植物检测、食品安全等不同研究领域[9,10]。目前，实时荧光定量PCR技术成为分子生物学研究中的重要工具[11～12]，而在植物害虫研究上的报道相对其他领域较少，但是随着最近几年实时荧光定量PCR技术的发展，有力地促进了植物害虫研究水平的提高，而且发挥着越来越重要的作用，已经显示出了极好的应用前景。

1 实时荧光定量PCR概述

1.1 荧光共振能量转移原理

实时荧光定量PCR的原理的基础是荧光共振能量转移原理，荧光共振能量转移原理（fluorescence resonance energy transfer, FRET），是指当一个荧光分子（供体分子）的发射光谱与另一个荧光分子（受体分子）的吸收光谱相重叠时，且两个集团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，相当于短波长荧光集团释放的荧光被屏蔽，这个过程称为FRET。

1.2 实时荧光定量PCR的原理

实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，随着PCR反应的进行，扩增产物不断积累，荧光信号的强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，从而得到一条荧光扩增曲线，利用荧光信号积累强度的变化实时监测整个PCR进程，在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，最后在这一阶段通过Ct值和标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在实时荧光定量PCR技术中有两个非常重要的概念：荧光阈值和Ct值。荧光阈值是指在荧光扩增曲线指数增长期设定的一个荧光强度标准，一般这个阈值是以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光基础信号，荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差10倍，如果检测到的荧光信号超过阈值才被认为是可信的信号。而在PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到荧光阈值时所经历的扩增循环数被称为Ct值，C代表循环（Cycle），T代表阈值（Threshold）[10]。对于Ct值与起始模板量关系的研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上得到该样品的起始拷贝数[11]。

1.3 实时荧光定量PCR的特点

实时荧光定量PCR与传统PCR相比，它具有诸多优点：⑴ 定量原理独特，用产生荧光信号的多少来显示扩增产物的量，实现了动态实时连续荧光监测，可视性强；⑵ 不需要PCR反应后的处理，而且只须在加样时打开一次盖子，大大降低了污染的可能性；⑶ 可以在很大浓度范围内(>10倍）进行定量，有较高的灵敏度、特异性和精确性；⑷ 既可以做定性分析又可以做定量分析[13～14]。同时该技术也与传统的PCR技术相比还有其不足之处：⑴ 由于减少了扩增后电泳的检测步骤，因此不能监测扩增产物的大小。⑵ 在标准曲线定量中，由于没有统一标准，各实验室所用的生成标准曲线的标准样品各不相同，致使试验结果缺乏可比性；⑶ 试验成本太高，也限制了其的应用范围；⑷ 由于该技术极其灵敏，所以对实验操作的精确度要求较高。

2 实时荧光定量PCR的分类

根据荧光基团标记和实现能量共振转移方式的不同，目前实时荧光定量PCR应用比较广泛的为四大类，分别是荧光染料（SYBR Green）、水解探针（Tapman）、杂交探针、分子信标，除此以外还有荧光标记引物，复合探针法，Lighf-uP、Cyclicons、LUXt、Scorpion、Amplifluor等[15～17]。

2.1 荧光染料（SYBR Green）

SYBR Green是一种能与dsDNA特异结合的染料，在PCR反应体系中，加入过量SYBR Green，SYBR Green特异地与dsDNA结合，发出荧光信号[18]。DNA结合染色的方法不需要使用特异性荧光标记的探针，相对简便，同时也降低了检测的成本，其特异性完全由PCR的引物所决定。其主要不足是：染料与DNA双链分子的结合是非特异性的，它可以和反应体系中所有DNA分子结合，易受到非特异性扩增和引物二聚体的影响，产生荧光干扰，实验容易产生假阳性信号，使定量结果不可靠。不过目前可以用熔解曲线分析来区分特异性和非特异性扩增，引物的设计和反应条件的优化对消除非特异性荧光也有很大帮助。

2.2 水解探针（Tapman）

目前在实时荧光定量PCR技术中应用较多的水解探针是Tapman探针。探针5’端标记一个荧光基团，3’端一个淬灭基团。探针完整时荧光基团和淬灭基团发生荧光共振能量转移（FRET），所以检测不到该探针5’端荧光基团发出的荧光。在PCR扩增过程中，由于Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针的荧光基团切下，荧光基团与淬灭基团远离，不能发生FRET而产生荧光信号，每扩增一条DNA链就有一个游离的荧光分子形成，可通过检测系统观察到信号的变化，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。利用标准品模板系列绘制出标准曲线，结合各样品的Ct值，可确定样品的起初模板量[19]。美国ABI公司推出另外一种水解探针为Tapman-MGB探针，它与Taqman探针相比能更好地稳定探针与模板的杂交，升高探针Tm值[20]，使较短的探针同样能达到较高的Tm值，简化了探针的设计，更有益检测单碱基突变。另一个优点就是由于其长度短于Taqman探针，荧光和淬灭基团的距离更近，淬灭效果更好，而使荧光背景更低。

2.3 杂交探针（Hybridization probe）

杂交探针技术主要是使用两个特异的探针，其中上游的探针的3’端标记供体荧光基团，而下游的探针的5’端标记有受体荧光基团。在PCR模板退火阶段，两探针同时与目的基因发生头尾结合形式的特异性结合，使供体和受体荧光基团距离非常接近，两者产生荧光共振能量转移，使得受体荧光基团发出荧光，当两探针处于游离状态时，无荧光产生。由于反应中运用了两个探针，因此增加了方法的特异性，但两个探针结合于模板上影响扩增效率。

2.4 分子信标（Molecular beacons）

分子信标技术是在同一探针的两末端分别标记荧光基团和淬灭基团，为一种标记荧光的发夹探针。在未与模板发生杂交前该探针分子呈发夹结构，结合在其两端的荧光基团距离上接近，产生能量转移效应，不发生荧光。当该探针与模板杂交，使荧光基团与淬灭荧光基团彼此在空间上产生足够的分离，荧光基团脱离了淬灭基团的影响，从而产生可被检测到的荧光。荧光的强度与溶液中模板的量成正比，因此可用于PCR定量分析[21]，若目标DNA序列同分子信标不能完全配对，杂交过程和信号不会出现。若在发夹结构中荧光标记物不能紧靠淬灭基团，会产生很强的背景信号。若分子信标内杂交过强，会妨碍同目标DNA分子的杂交，使得荧光信号不能充分释放。最佳的分子信标应有合适的熔链特性。分子信标可检测单个核苷酸的突变，适于SNP分析和等位基因突变分析。但设计较难，既要避免产生强的背景信号，又要避免茎部杂交过强，影响其与模板退火，从而影响荧光生成。

3 实时荧光定量PCR的定量方法

在实时荧光定量PCR中，有两种定量模板的方法：绝对定量和相对定量。绝对定量指用已知的标准曲线来推算未知的样本量；相对定量指在一定样品中靶序列相对于另一参照序列的量的变化[22]。

3.1 相对定量

相对定量指的是在一定样本中靶序列相对于另一参照样本的量的变化。此方法与绝对定量的标准曲线法基本相似，不同之处是未知样品的量是相对于某个参照物的量而言。因此，相对定量的标准曲线比较容易制备，对于所用的标准品只需知道其稀释度即可。

3.2 绝对定量

绝对定量指的是用已知的标准曲线来推算未知的样本的量。此方法标准品的量是预先已知的。将标准品稀释成不同浓度的样品，并作为模板进行PCR反应。以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的Ct值为纵坐标，绘制标准曲线。对未知样品进行定量时，根据未知样品的Ct值，即可在标准曲线中得到样品的拷贝数。质粒DNA和体外转录的RNA常作为绝对定量的标准品。

3.3 比较Ct法的相对定量

即△Ct值法，此方法是同时扩增待测靶基因片段和一个作为内参照的基因片段，一般是一个内源性管家基因片段。通过测两者的Ct值之差（△Ct），比较不同待测标本DNA的△Ct值与正常标本DNA的△Ct值的变化，可对未知标本靶基因的原始拷贝数作出判断。

4 实时荧光定量PCR技术在植物害虫方面的应用

目前，实时定量PCR技术应用于植物害虫鉴定、防治等研究相对其他领域较少，但该技术在植物害虫、植物病原线虫和害螨研究中已经显示出了极好的应用前景。

4.1 在植物害虫鉴定及检测研究中的应用

传统的植物害虫鉴定方法依赖于形态特征和寄主范围等特征来区分，但是对于一些植物害虫之间的区分比较困难，尤其是检疫性植物害虫实蝇类，蓟马类等，而实时定量PCR技术是解决这一问题的可靠手段。余道坚[23]应用TaqMan探针和SYBR Green实时荧光PCR技术，分别建立了两种快速鉴定重要检疫性害虫辣椒实蝇（Bactrocera latifrons）的方法。同时余道坚等[24]还应用SYBR Green实时定量荧光PCR技术，分别建立了SYBR Green实时荧光PCR快速鉴定菲立滨实蝇（bactrocera philippinensis）和芒果实蝇（bactrocera occiptalis）的方法。实现了对检疫性实蝇快速准确的鉴定。徐浪等[25]应用TaqMan实时荧光定量PCR方法，实现了对形态学方法很难鉴别的大洋臀纹粉蚧（Planococcus minor）和南洋臀纹粉蚧（Planococcus lilaciu）进行准确鉴定，从而达到快速鉴定检疫性粉蚧的目的。K.Walsh等[26]利用TaqMan实时荧光定量PCR技术，建立了快速鉴定重要检疫性害虫南黄蓟马（Thrips palmi）的方法。K.S.Huang等[27]也应用TaqMan实时荧光定量PCR技术建立了快速鉴定重要检疫性害虫西花蓟马（Frankliniella occidentalis）的方法。

另外，实时定量PCR还可以用来检测土壤中的害虫。KAREN HERBERT等[28]利用TaqMan荧光定量PCR技术，结合土壤DNA的提取，对土壤中葡萄根瘤蚜（Daktulosphaira vitifoliae）若虫进行了检测，表明实时荧光定量PCR在检测土壤中植物害虫和监测种群动态变化方面具有很好的前景。

4.2 在植物害虫生理研究中的应用

实时荧光定量PCR技术在植物害虫生理研究中也有很好应用前景。崔旭红等[29]利用TaqMan-MGB探针和特异性引物构建了B型烟粉虱（Bemisia tabaci）hsp70实时荧光定量RT-PCR检测体系，对HSP70在B型烟粉虱抵抗高温胁迫中的作用进行研究。翟会芳等[30]也构建了实时荧光定量RT-PCR体系，研究了HSP90在甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）幼虫抗高温中的作用。证明了该技术是研究植物害虫抗逆性和相关基因表达的理想工具。Kanako Komaki等[31]利用实时荧光定量PCR和荧光测定法对各虫态豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）细胞内共生细菌（Buchnera）的基因拷贝数进行了研究，证明了该技术是研究植物害虫体内共生菌变化的灵敏工具。

4.3 在植物害虫防治研究中的应用

实时荧光定量PCR植物害虫防治研究中也有出色的表现。Lei等[32]利用实时荧光定量PCR技术对酚氧化酶原-2（PxPPO2）在小菜蛾（Plutella xylostella）不同虫态中的转录量进行研究，可以通过降低PxPPO2的转录水平开发新型性杀虫剂。张清平等[33]利用基于绿僵菌rDNA基因片段设计的PCR引物对、优化的DNA制备方法以及荧光定量PCR技术，对早期东亚飞蝗（Locusta migratoria manilensis）体内的病原真菌DNA进行简便、快速、灵敏、准确的检测，并确定病原真菌在其内的增殖速率和动态变化。杨和平等[34]利用荧光定量PCR技术检测了甜菜夜蛾病毒杀虫剂中甜菜夜蛾核型多角体病毒有效含量。证明了荧光定量PCR技术可以用于杀虫剂有效生物含量的测定。James A.Anstead等[35]利用实时荧光定量PCR技术建立了准确检测导致桃蚜（Myzus persicae）对拟除虫菊酯类杀虫剂产生抗药性的两个基因突变位点L1014F（kdr）和 M918T（super-kdr）。Y.P.Chen等[36]利用实时荧光定量PCR对舞毒蛾（Lymantria dispar）被刻绒茧蜂（Glyptapanteles indiensis）寄生后不同时期不同组织中的GiPDV 1.1的表达量进行检测，证明该方法是一种可用于基因表达分析很好的工具。

4.4 在植物病原线虫和螨类研究中的应用

近年来，实时荧光定量PCR技术也开始的应用于植物病原线虫和害螨的研究，并获得很好的研究成果。王焱等[37]分别用特异性引物法、ITS-PCR-RFLP法和实时荧光PCR法对松材线虫进行了检测，结果表明实时荧光PCR法耗时短，灵敏度高，适合用于松材线虫的检验检疫。国内外多篇文献均有报道了应用实时荧光定量PCR技术，不仅能快速、准确的对松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）进行鉴定，也能够对线虫进行定性和定量分析[38～41]。王明旭等[42]利用松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）和拟松材线虫（B．mucronatus）的rDNA-ITS2种间差异显著特性，设计TaqMan探针，用实时荧光PCR的检测方法能准确地区别2种线虫。Berry等[43]建立了爪哇根结线虫（Meloidogyne javanica），玉米根腐线虫（Pratylenchus zeae）和桑大型针线虫（Xiphinema elongatum）的实时荧光定量 PCR检测方法，对寄生甘蔗的三种线虫实现了灵敏，准确的检测和定量。王翀等[44]设计鳞球茎茎线虫（Ditylenchus dipsaci）特异的TaqMan 探针，建立了实时荧光 PCR 检测方法。贺俊飞等[45]利用实时荧光定量PCR检测中华卵索线虫（Ovomermis sinensis）体内tra-1基因表达量，研究tra-1基因在中华卵索线虫雌性生殖系统的发育、卵的形成以及胚胎的发育中的调控作用。Madani等[46]利用SYBR Green实时荧光定量，对马铃薯胞囊线虫（Globodera pallida）以及甜菜胞囊线虫（Heterodera schachtii）进行检测和定量。Zhang等[47]利用实时荧光定量 PCR定量检测潜在植物寄生线虫生防菌-洛斯里被毛孢子的种群密度，研究食线虫真菌的DNA量和被寄生线虫的百分比之间的关系，并可结合生物测定监测土壤真菌的生物量和活性效果。李明等[48]运用real-time PCR分析冷激和热激后HSP70基因TCHSP70-4在朱砂叶螨体内的表达量，对朱砂叶螨（Tetranychus cinnabarinus（Boisduval））热激蛋白HSP70的表达与其适应高温和低温胁迫的关系进行了研究。

5 小结

实时荧光定量PCR技术是近年来发展起来的新的检测方法，与常规RT-PCR相比具有明显优越的灵敏度、特异性、稳定性和操作简便的特点，但仍有些问题需解决，如自动化仪器﹑试剂及其检测的成本等。近些年来，实时荧光定量PCR技术还广泛应用于植物营养学研究、植物发育学研究、植物抗逆机理研究、转基因植物的检测、植物与微生物互作机理研究、植物抗病性检测、信号转导、环境对植物基因表达的影响等方面[49]。在植物病虫害研究的许多领域显现出它的优越性，并开始被广泛应用。

许多科研工作者基于荧光PCR的基本原理对荧光PCR技术进行不断深入的研究和改进，使荧光PCR技术得到了进一步的完善，并在此基础上开发出了许多新的实时荧光定量PCR技术。而实时荧光定量PCR技术与生物基因芯片技术结合会使FQ-PCR技术进一步完善，可提高其在生命科学领域的应用范围和普及程度，FQ-PCR将成为未来植物害虫研究的必备工具，在植物保护领域将得到更加广泛的应用。

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致谢：承蒙中国农业科学院植物保护研究所冯洁研究员审阅、修改本文。