食用白酒对实验性肝纤维化TGF-β1的影响

刘春光 （公安县人民医院消化内科，湖北 公安434300）

卢 平 （长江大学荆州临床医学院 荆州市中心医院消化内科，湖北 荆州434020）

肝纤维化是各种慢性肝损伤共有的组织变化，和肝硬化是连续的发展过程，为可逆性病变，其中心环节是肝星状细胞 （HSC）激活并转化成肌成纤维细胞样细胞 （MFB）、细胞外基质 （ECM）过度合成和基质降解能力下降。转化生长因子-β1（TGF-β1）为现知最强力的肝纤维化促进因子，是激活HSC并促进其表达ECM的关键因子。国内有学者报道了贵州茅台酒能延缓肝纤维化的发展［1］，引起了关注。我们通过观察茅台酒对实验性肝纤维化TGF-β1信号转导的影响，来探讨茅台酒对肝纤维化的影响。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 实验动物 雄性 Wistar大鼠79只，体质量230～270g，常规条件下饲养 ，温度 （22±2）℃，湿度 （55±5）%，人工照明1h，自由取水取食，饲料由公司提供，饮用水为自来水饲养。

1．1．2 试剂 53% （V／V）贵州茅台酒 （批号：6845169830，验证码：5212635463568104），无水乙醇 （分析醇），四氯化碳 （CCL4）分析纯，蓖麻油分析纯，0．9%氯化钠溶液。

1．2 方法

1．2．1 动物模型的制备 按照随机数字表随机分成6组。①正常对照组 （n＝9）：0．9%氯化钠溶液灌胃 （0．3ml／100g，1次／d。下同）；②茅台酒 CCL4组 （n＝12）：40%CCL4蓖麻油溶液皮下注射（0．2ml／100g，2次／周，首剂加倍。下同），同时给予53% （V／V）贵州茅台酒灌胃 （0．3ml／100g，1次／d。下同）；③乙醇CCL4组 （n＝13）：40%CCL4蓖麻油溶液皮下注射同时，给予53% （V／V）乙醇灌胃 （0．3ml／100g，1次／d。下同）；④茅台酒组 （n＝14）：53% （V／V）贵州茅台酒灌胃；⑤乙醇组 （n＝16）：53% （V／V）乙醇灌胃；⑥CCL4造模组 （n＝15）：40%CCL4蓖麻油溶液皮下注射，同时生理盐水灌胃。

1．2．2 观测指标及方法 实验第2周，CCL4造模组、乙醇CCL4组分别死亡1只。实验第4周和第8周末分批处死动物40、37只，取血和肝脏。血清标本在-20℃保存待测，同时取肝脏组织，记大体情况，取部分肝脏固定于4%多聚甲醛内，常规石蜡包埋，2μm连续切片。①血清肝功能检测：采用全自动生化仪测定ALT、AST、ALB血清浓度的改变；②血清肝纤维化检测：放射免疫法检测层粘连蛋白（LN）、Ⅲ型前胶原 （PCⅢ）血清浓度的改变；③免疫组织化学法检测TGF-β1：采用SABC法，用DAB显色，严格按照试剂盒的说明书进行操作；一抗浓度均为1∶150，阴性对照用PBS代替一抗。结果判定：阳性染色者在细胞浆或／和细胞膜呈棕色颗粒沉着。随机取5个高倍视野计数阳性细胞，小于5% （-），6%～25% （＋），26%～50% （＋＋），51%以上为 （＋＋＋）。④病理形态学观察：HE染色，由同一病理专科医师光镜下做肝纤维化病理学分级［2］：0级，无纤维化；Ⅰ级，汇管区扩大，纤维化；Ⅱ级，汇管区周围纤维化或纤维间隔形成，小叶结构保留；Ⅲ级，纤维间隔大量形成伴小叶结构混乱，无肝硬化；Ⅳ级，肝硬化。

1．3 统计学分析

实验结果以±s表示，采用SPSS统计软件包（11．5版）进行统计学分析，计量资料用t检验；计数资料采用秩和检验。P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2．1 各组大鼠血清肝功能变化

同正常对照组相比，各造模组ALT、AST水平明显升高 （P＜0．05），茅台酒组和乙醇组ALB有一个先升高后降低的过程，茅台酒CCL4组、乙醇CCL4组、CCL4组ALB水平持续降低。同正常对照组相比，茅台酒组的ALT、AST在第4周末无统计学差异性 （P＞0．05），两组ALB差异有统计学意义（P＜0．05），到第8周末时ALT有统计学差异 （P＜0．05），ALB差异无统计学意义 （P＞0．05）；乙醇组ALT、AST在第4周末、第8周末有统计学差异 （P＜0．05），ALB差异无统计学意义 （P＞0．05）。同CCL4组相比，乙醇CCL4组在第4周末、第8周末对肝功能的影响差异无统计学意义 （P＞0．05），在第8周末茅台酒CCL4组ALB有统计学差异 （P＜0．05）。在第4周末，茅台酒和乙醇组比较，ALT、ALB有统计学差异 （P＜0．05），AST差异无统计学意义 （P＞0．05），到第8周末，ALT仍有统计学差异 （P＜0．05），ALB差异无统计学意义 （P＞0．05）。在第4周末、第8周末茅台酒CCL4组、乙醇CCL4组肝脏功能差异无统计学意义 （P＞0．05）。第8周末同第4周末相比，茅台酒组ALT、AST差异无统计学意义 （P＞0．05），ALB有统计学差异 （P＜0．05）。见表1。

2．2 对血清LN、PCⅢ的影响

各个造模组的LN、PCⅢ均升高，茅台酒组升高不明显，其他各组明显升高 （P＜0．05）。在第4周末，茅台酒组和乙醇组、乙醇CCL4组和茅台酒CCL4组的LN之间有统计学差异 （P＜0．05），但是PCⅢ差异无统计学意义 （P＞0．05）。在第4周末，同CCL4组比较，乙醇组PCⅢ有统计学差异（P＜0．05），LN则差异无统计学意义 （P＞0．05），乙醇CCL4组LN、PCⅢ无统计学意义 （P＞0．05）。在第8周末，同CCL4组相比，乙醇组、茅台酒CCL4组PCⅢ有统计学差异 （P＜0．05），LN无统计学意义 （P＞0．05），茅台酒组LN、PCⅢ有统计学差异 （P＜0．05）。在第4周末、第8周末，同对照组比较，乙醇组、茅台酒CCL4组、乙醇CCL4组、CCL4组LN、PCⅢ有有统计学差异 （P＜0．05），茅台酒组LN、PCⅢ无统计学意义 （P＞0．05）。第8周末同第4周末相比，茅台酒组LN、PCⅢ无差异性。见表2。

在第4周末、第8周末，同组大鼠血清肝功能和纤维化指标的比较见表3。

2．3 各组大鼠肝纤维化病理学表现

正常对照组肝小叶内网状纤维支架完整，分布规则，无胶原纤维存在。四氯化碳造模组、茅台酒四氯化碳组、乙醇四氯化碳组第4周末出现纤维间隔，肝脏细胞大量空泡变性，脂肪变性，部分小叶结构混乱。到第8周末，大量老鼠肝脏组织内假小叶形成，部分出现肝脏硬化。茅台酒组只有部分出现肝纤维化，罕见纤维间隔。在第4周末、第8周末：同对照组相比，茅台酒对纤维化的病理学分级无统计学意义 （P＞0．05），乙醇组则有统计学差异 （P＜0．05）；同CCL4组相比，茅台酒组、乙醇组有统计学意义 （P＜0．05），茅台酒CCL4组、乙醇CCL4组无统计学差异 （P＞0．05）；茅台酒组和乙醇组之间病理学分级有统计学意义 （P＜0．05），茅台酒CCL4组和乙醇CCL4组之间没有统计学差异 （P＞0．05）。第8周末同第4周末相比，茅台酒组病理学分级无统计学意义 （P＞0．05），乙醇组、茅台酒CCL4组、乙醇CCL4组、CCL4组有统计学意义 （P＜0．05）。见表4。

表1 各组Wistar大鼠血清肝功能结果

表2 各组大鼠血清LN、PCⅢ的变化

表3 各组Wistar大鼠血清肝功能和纤维化指标在第4周末、第8周末的比较

表4 各组Wistar大鼠肝纤维化病理学分级 例

2．4 对TGF-β1 表达的影响

TGF-β1在正常肝脏门静脉周围细胞及小叶中央静脉周围细胞和汇管区的结缔组织偶见表达，着色较淡。随着肝纤维化程度的逐步加重，其阳性表达越来越明显，在汇管区周围非实质细胞、窦壁细胞、纤维间隔、窦周细胞、中央静脉周围细胞及部分肝脏细胞均见阳性表达。在第4周末、第8周末，茅台酒组和乙醇组之间TGF-β1阳性表达有统计学意义 （P＜0．05）。茅台酒CCL4组和乙醇CCL4组之间无统计学差异P＞0．05）。同对照组相比，乙醇组TGF-β1阳性表达有统计学差异 （P＜0．05），茅台酒组差异无统计学意义 （P＞0．05）。同CCL4组相比，茅台酒CCL4组、乙醇CCL4组TGF-β1阳性表达差异无统计学意义（P＞0．05）。第8周末同第4周末相比，茅台酒组TGF-β1阳性表达无统计学意义 （P＞0．05），乙醇组、茅台酒CCL4组、乙醇CCL4组、CCL4组TGF-β1阳性表达有统计学意义 （P＜0．05）。见表5。

表5 各组大鼠TGF-β1表达的变化 例

3 讨 论

肝纤维化是各种慢性肝损伤共有的组织变化，病理特点为汇管区和肝小叶内ECM过度沉积。其中心环节是HSC激活并转化成MFB、ECM过度合成和基质降解能力下降。TGF-β1能促进HSC合成胶原、纤维连接蛋白及蛋白多糖等细胞外基质，并抑制间质金属蛋白酶 （MMPs）合成，促进HSC分泌金属蛋白酶组织抑制物 （TIMPs）等而减少ECM的降解［3］。

现有研究证明阻断TGF-β1信号通路可明显阻断肝纤维化进展［4］。TGF-β1信号分子通过跨膜的受体复合物进行信号转导。本实验研究表明，茅台酒对LN、PC的影响不明显，乙醇却有明显的影响。同CCL4组相比，茅台酒CCL4组在第8周末对ALB、PCⅢ的影响显示出统计学差异，乙醇CCL4组无统计学变化，提示同乙醇相比，茅台酒可以延缓四氯化碳造成的纤维化损伤。

在本研究中，茅台酒组对TGF-β1表达的影响和乙醇组间有统计学差异。TGF-β1是激活HSC的关键因子。在茅台酒的影响下，其阳性表达降低，会对肝纤维化的发展有一定的抑制作用。

茅台酒是知名国酒，其含有一定量蛋白质，18种氨基酸，多种维生素和微量元素，富含超氧化物歧化酶，甲醇、苯和醛类化合物的含量远低于国际标准。并有初步的研究表明茅台酒可以诱导肝脏金属硫蛋白含量增加［1］。在我们的研究中，茅台酒组对肝脏有一定的损伤，但茅台酒没有显著增加TGF-β1的表达，可通过影响TGF-β信号转导对肝纤维化有一定的抑制作用。

［1］程明亮，吴君，张文胜，等 ．茅台酒对肝脏的作用及其影响的实验研究 ［J］．中华医学杂志，2003，83（2）：237-241．

［2］Hayasaka A，Saisho H．Serum markers as tools to monitor liver fibrosis ［J］ ．Digestion，1998，59：381-384．

［3］Gressner A M．Roles of TGF-beta in hepatic fibrosis ［J］．Front Biosci，2002，7：793-807．

［4］汪玲，胡国龄，谭德明 ．TGF-β1Ⅱ型受体部分基因表达质粒对实验性大鼠肝纤维化的影响 ［J］．中华传染病杂志，2002，20（3）：168-171．