结核病的分子生物学诊断技术研究进展

路 超，刘义庆，王长印，卢志明

(山东大学附属省立医院，济南 250021)

近10余年来，结核病发病呈全球持续恶化，2007年死于结核病的患者约177万［1］。结核杆菌是结核病的主要致病菌，可在人群中传播，对外界环境的抵抗力强，易产生耐药菌株。传统的病原学检查简便易行，但特异性、灵敏度较差，血清学等敏感性或特异性不理想。分子生物学诊断技术是一种简便、快速、灵敏、特异、试剂稳定、无危害性的结核病诊断和分类鉴定方法，现对其研究进展综述如下。

1 结核杆菌的分子生物学特点

1998年英国Sanger中心和法国的Pasteur研究所合作开展了结核分枝杆菌H37Rv株的全基因组测序工作［2］，证实结核杆菌全基因组由4 411 529 bp组成，富含许多重复序列，尤其是插入序列，亦包括新的基因家族和管家基因。GC碱基含量高达65.6%，有约3 924个开放阅读框，其中约40%有功能，44%可能有功能，16%称为孤独序列。间隔子是断裂基因中所具有的非编码序列，结核分枝杆菌的顺向重复序列被非重复的独特间隔子(长度34～41 bp)分隔。主要的多态串联重复是结核分枝杆菌染色体中一种主要类型的重复DNA，由10 bp的短串联重复序列被5 bp的间隔子分隔组成。重组质粒PTBN12包含有一个3.4 kb的插入序列。2001年Fleischmann等［3］对结核杆菌CDC1551全基因组进行测序工作，并与H37Rv株的序列进行比较，得出基因多样性在结核病发生、发展中扮演重要角色的结论。

2 结核病的分子生物学诊断技术

2.1 核酸扩增技术 PCR技术及其他体外核酸扩增技术在结核病领域的应用，为结核病的诊断和鉴别诊断开辟了新途径。

2.1.1 单纯PCR技术 ①经典的PCR技术。选用一对特异性引物进行扩增，通过检测扩增后的目的片段来鉴别细菌。此方法一般仅能将细菌鉴别到属或群，对种的鉴别意义不大。Elbir等［4］报道了一种简单、快速、敏感的菌落PCR技术，不需抽提结核分枝杆菌的DNA，直接在反应混合物中加入乙醇，可于2 h内有效杀死结核分枝杆菌，其认为该法可简化诊断步骤，降低操作者潜在感染几率。②非经典的PCR技术。包括逆转录PCR及巢式PCR、半巢式PCR。逆转录PCR时一个细胞中rRNA数量是DNA的100倍，因此扩增产物增多，试验的灵敏度大大提高。该法可用于结核病的诊断，缺点是无法区别死菌和活菌。巢式PCR、半巢式PCR采用内外两对引物，进行两次扩增，内引物以外引物扩增产物为模板进行第二次扩增。可提高检测的灵敏度，亦可从临床标本中直接检出结核分枝杆菌，能用于种属鉴别。单管平衡半巢式PCR可有效控制污染，提高扩增效率;单管巢式逆转录PCR可区分死菌与活菌。

2.1.2 在PCR基础上发展的核酸扩增技术 ①PCR-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)。是检测单碱基突变可靠而简便的方法。PCR产物为两条互补单链，各单链的碱基序列不同可形成不同的空间构象，在凝胶上显示不同的带型，可确定有无突变。目前采用PCR-SSCP技术分析耐多药结核杆菌的耐药机理已成为研究热点，尤其是该法直接检测临床标本中结核杆菌耐药基因的成功，将会对传统结核药敏试验产生新的挑战。Sheen等［5］学者检测比嗪酰胺的耐药基因，与其他四种技术相比，PCR-SSCP技术快速、高效、价格低廉，对指导临床治疗及用药有一定应用价值。另有学者用PCRSSCP技术检测了22株耐多药的结核药菌株katG、rpoB、rpsl基因突变，分别检出突变基因16株、19株、14株，但该法不能确定突变部位和性质，对操作技术要求过高，影响因素较多，目前只在条件较好的实验室开展研究。②序列特异引物—多聚酶链反应(PCR-SSP)。PCR-SSP的引物是根据不同类型核心序列关键几处碱基的差异而设计，产物经电泳分离，呈现为不同的阶梯状扩增片段图谱。墨西哥学者Méndez等［6］首次用PCR-SSP技术检测结核病患者KIR基因多态性，简单、快速。③PCR与核酸探针技术的结合。当靶基因存在时，产生荧光，荧光的强度与PCR产物量呈正比，可定量测定。实时荧光定量PCR具有引物和探针的双重特性，可提高目的基因检测的特异性。Pinsky等［7］用了一种稳定、快速、两步多重实时PCR技术，在60个临床样品中，检测到3例为卡介苗，57例为结核分枝杆菌，可用于常规临床实验室。另有学者介绍了一种宽范围定量的巢氏Real-Time PCR检测结核分枝杆菌的方法，具有较高的准确性和较广的检测范围。另外，分子灯塔技术亦适合于检测点突变。Gomez等［8］为了增加其临床应用价值，建立了一个客观的检测rpoB突变的分子信标qPCR方法，敏感度和特异性均提高。④限制性片段长度多态性及限制性内切酶分析。是以PCR为基础的分类鉴定技术和限制性内切酶分析相结合的技术。扩增产物经限制性内切酶消化，不同分枝杆菌电泳图谱呈现多态性。Caws等检测了耐异烟肼的KatG-315突变基因，与传统药敏试验相比，其敏感性提高到80%，而特异性可达100%。有研究通过对65 kD蛋白基因的PCR产物进行限制性酶切分析，准确检测出结核杆菌的属内归属。限制性片段长度多态性及限制性内切酶分析法是鉴定分枝杆菌种的可靠程序，较形态学和生理、生化特征等常规方法更准确、快速。⑤PCR-基因缺失分析。分析结核分枝杆菌H37Rv全基因组序列后发现，有16个区域(RD1-RD16)在结核分枝杆菌成员中缺失存在差异。因此，应用PCR技术探查基因组特异的区域是否存在，通过特定的缺失图谱可区别各成员。Pounder等［9］应用PCR基因缺失—解链温度分析结核分枝杆菌的不同成员，准确率为94%。该方法最突出的优点是可简单快速地鉴别MTC成员。⑥随机扩增多态性DNA。原理是用一条人工合成寡核苷酸引物对整个DNA链进行探查，在较低温度下与匹配或部分匹配的退火位点结合，扩增出呈现多态的DNA片段，经电泳后可得到DNA指纹图谱，从而进行菌种鉴定。Esteban等检测鉴定了戈登分支杆菌，此方法对标本要求不高，简单快速，成本较低，且又无需预知靶DNA序列。⑦逆转录—环介导等温扩增—酶联免疫法(RT-LAMP-ELISA-hybridization)。由 Lee 等［10］发明的一种新技术，用于快速检测结核分枝杆菌的16S rRNA，检测灵敏度为94.1%，高效、低价，有望用于常规临床检测。⑧异源双链分析。是将含有突变基因和同段无突变基因PCR扩增产物混合，加热变性后再复性，若待测基因有突变，则在复性过程中可形成部分来源于突变与无突变基因的异源双链，同时亦形成部分同源双链。根据电泳迁移率的差别判断有无基因突变。

2.2 DNA探针技术 核酸探针是指用放射性或非放射性物质标记已知DNA或RNA片段，检测样品中未知的核苷酸序列，经显影、显色或荧光检测的方法，将结合核苷酸的位置或大小显示出来。迄今为止，用于结核杆菌快速检测和鉴定的探针有cDNA探针、全染色体核酸探针、寡核苷酸探针、克隆核酸探针和DNA片段探针等，检测方法有膜斑点杂交、原位杂交、印迹杂交和液相杂交等。核酸探针技术的显著特点是高度特异性，可用于结核病的诊断、菌种鉴定和耐药性检测等方面，使用最广泛的是反向斑点杂交技术及反向线点杂交技术。有学者鉴定了15种临床上常见的分枝杆菌，与传统的生化试验和测序相比敏感性和特异性均为100%。基因芯片基于反向杂交技术，将大量靶基因探针高密度排列固定于一块特殊处理的载体上，标记的PCR产物与载体上的探针进行杂交，以特定仪器检测杂交信号而对细菌进行鉴定。Sanguinetti等［11］用此技术进行检测，需样本少、准确、信噪比极小且易于操作，开辟了新的临床诊断视野。由于芯片制备较复杂，检测成本高，临床实验室很难推广使用。WHO推出了一种线性探针检测法，由德国一家企业开发，可直接用患者的唾液来判断其中的结核菌是否对两种常用药物具有抗药性，便于医生快速做出诊断。

2.3 指纹图谱技术 在结核分枝杆菌染色体DNA中选择合适的重复序列作为遗传标志，建立DNA指纹图谱技术，可检测出流行病学上无关菌株的DNA多态性。用限制性内切酶消化结核分枝杆菌染色体DNA上特定的核苷酸序列，电泳分离后，将片段转移至膜上，与带标记的DNA探针杂交，检测出与探针同源的限制性片段，其片段的数目和大小的变化使每株分离株呈特征性带型。PCR双脱氧指纹图谱是由PCR-SSCP和双脱氧DNA测序结合产生的一种方法，主要用于结核菌耐药型测定。

2.4 DNA测序技术 包括双脱氧链终止法、化学降解法、PCR测序法及DNA测序仪的应用。焦磷酸测序法准确性更优于传统测定法，是检测分枝杆菌特异性核苷酸序列最直接可靠的方法，已成为菌种鉴定的“金标准”。Bao等［12］学者对焦磷酸测序法及常规分型法、SANGER法进行比较发现，焦磷酸测序法鉴别抗酸杆菌的准确率为98%。目前，DNA序列测定不仅可鉴别应用生化试验难以鉴别的菌种，而且可鉴定某些少见的或需特殊营养成分的分支杆菌菌种，不仅能用于基因突变的检测，且能确定突变的性质与部位。Che等［13］用序列分析法检测了与结核相关的IRGM基因多态性，结果在其启动子区域发现29个多态性位点。

2.5 高效液相色谱技术 根据离子对反相高效液相色谱技术的原理，通过DNA分离柱，对核酸片段进行分离和分析。一些学者采用此技术对抗结核药物耐药性相关基因突变进行筛选的结果再次肯定高效液相色谱技术用于分枝杆菌鉴定的可行性。通过研究耐药基因的突变点，结合序列分析，成为简单高效快速的检测结核病耐药基因较实用的方法。变性高效液相色谱技术是一种新的基因检测技术，在分枝杆菌基因分型鉴定及耐药基因检测方面均有较大应用价值。

随着分子生物学技术和交叉学科的发展，目前临床实用而颇具开发价值的反向杂交技术已显示出极大优势，适合在地区级分枝杆菌实验室开展。DNA测序是公认的鉴定菌种和检测耐药基因突变的“金标准”，随着测序仪不断改进，其应用可望普及。此外，液相芯片技术亦具有良好应用前景。结核病分子生物学的研究在不同领域已取得较大进展，随着各种技术不断完善与发展，分子生物学将为结核病的诊断、治疗、流行病学调查等提供更大帮助。

［1］Glaziou P，Floyd K，Raviglione M.Global burden and epidemiology of tuberculosis［J］.Clin Chest Med，2009，30(4):621-636.

［2］Cole ST.Learning from the genome sequence of Mycobacterium tuberculosis H37Rv［J］.FEBS Lett，1999，452(1-2):7-10.

［3］Fleischmann RD，Alland D，Eisen JA，et al.Whole-genome comparison of Mycobacterium tuberculosis clinical and laboratory strains［J］.J Bacteriol，2002，184(19):5479-5490.

［4］Elbir H，Abdel-Muhsin AM，Babiker A.A one-step DNA PCR-based method for the detection of Mycobacterium tuberculosis complex grown on Lowenstein-Jensen media［J］.Am J Trop Med Hyg，2008，78(2):316-317.

［5］Sheen P，Méndez M，Gilman RH，et al.Sputum PCR-single-strand conformational polymorphism test for same-day detection of pyrazi-namide resistance in tuberculosis patients［J］.J Clin Microbiol，2009，47(9):2937-2943.

［6］Méndez A，Granda H，Meenagh A，et al.Study of KIR genes in tuberculosis patients［J］.Tissue Antigens，2006，68(5):386-389.

［7］Pinsky BA，Banaei N.A multiplex，real-time PCR assay for rapid identification of Mycobacterium tuberculosis complex members to the species level［J］.J Clin Microbiol，2008，46(7):2241-2246.

［8］Gomez DI，Fisher-Hoch SP，Bordt AS，et al.Systematic interpretation of molecular beacon polymerase chain reaction for identifying rpoB mutations in Mycobacterium tuberculosis isolates with mixed resistant and susceptible bacteria［J］.Diagn Microbiol Infect Dis，2010，67(1):37-46.

［9］Pounder JI，Anderson CM，Voelkerding KV，et al.Mycobacterium tuberculosis complex differentiation by genomic deletion patterns with multiplex polymerase chain reaction and melting analysis［J］.Diagn Microbiol Infect Dis，2010，7(1):101-105.

［10］Lee MF，Chen YH，Peng CF.Evaluation of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification in conjunction with ELISA-hybridization assay for molecular detection of Mycobacterium tuberculosis［J］.J Microbiol Methods，2009，76(2):174-180.

［11］Sanguinetti M，Novarese L，Posteraro B，et al.Use of microelectronic array technology for rapid identification of clinically relevant mycobacteria［J］.J Clin Microbiol，2005，43(12):6189-6193.

［12］Bao JR，Master RN，Schwab DA，et al.Identification of acid-fast bacilli using pyrosequencing analysis［J］.Diagn Microbiol Infect Dis，2010，67(3):234-238.

［13］Che N，Li S，Gao T，et al.Identification of a novel IRGM promoter single nucleotide polymorphism associated with tuberculosis［J］.Clin Chim Acta，2010，411(21-22):1645-1649.