荧光定量PCR对儿童肺炎支原体感染早期诊断和临床意义

张永峰，王永芹

(潍坊医学院附属医院，山东 潍坊 261031)

肺炎支原体(MP)是小儿呼吸道感染的常见病原体之一，并有逐年上升趋势。2007年3月～2009年3月，我们采用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)法对320例肺炎患儿集咽拭子、血等标本进行检测，探讨荧光定量PCR对儿童肺炎支原体感染的早期诊断价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 肺炎患儿320例，男174例，女146例;年龄3个月～14岁，平均4.8岁。间接免疫荧光法检测咽拭子呼吸道合胞病毒、腺病毒、EB病毒、流感病毒等常规病毒抗体均为阴性，依据第7版《实用儿科学》的标准。双份血清抗体4倍以上升高或单次血清抗体滴度≥1∶160作为肺炎支原体感染诊断标准。急性期238例，其中轻症(肺部体征轻，胸部X线表现为支气管肺炎改变或间质性肺炎改变或大叶性肺炎单叶受累)187例，重症(肺部体征明显，有实变体征，胸部X线表现为大叶性肺炎改变，两个肺叶受累或有胸水和或有肺外并发症)51例;恢复期82例。

1.2 检测方法 患儿入院后24 h内和恢复期行标本采集，用无菌生理盐水棉拭子直接擦拭咽后壁，浸于1 ml无菌生理盐水中震荡，密封冰盒运送，－20℃保存，采用实时荧光定量基因扩增仪(FTC-2000A)测定MP-DNA，严格按照试剂盒说明操作;病程第5～7天及相隔1～2周采集静脉血，采用微量颗粒凝集法测定MP抗体;荧光定量PCR法测定血MP-DNA，结果判定:阈值之上出现扩增曲线，Ct值＜38为阳性，由仪器自动算出DNA含量(基因拷贝数/ml);Ct值＞40为阴性，38～40为灰区，建议复查。

1.3 统计学方法 采用SPSS10.0统计软件。计数资料比较比较采用χ2检验，计量资料比较采用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

320例患儿中微量颗粒凝集法阳性116例，阳性率为36.3%;荧光定量PCR法阳性有108例，阳性率为33.8%;两种方法均阳性96例，均阴性192例，符合率为91.8%。两种检测方法无统计学差异。320例患儿中，微量颗粒凝集法首次血清抗体＜1∶160的有204例，采集二次血清检测抗体，双份抗体呈4倍增高者35例，荧光定量PCR法32例为阳性。双份抗体增高不足4倍者169例，其中荧光定量PCR法亦为阴性者154例，二者符合率为90.12%。咽拭子和血标本中MP-DNA阳性率分别为33.8%、18.8%，MP-DNA 拷贝量分别为(3.70 ±0.44) ×102、(4.36 ± 0.53) × 103copy/ml，两者比较P均＜0.01。重症患儿血液及咽拭子MP-DNA的拷贝数分别为(8.53±2.27) ×102、(3.25±1.61) ×103copy/ml，轻症患儿分别为(3.31 ±1.51)×102、(2.92 ±1.76) × 103copy/ml，两者比较 P 均＜0.01。MP感染患儿急性期血液、咽拭子MP-DNA的拷贝数分别为(4.61±2.85) ×102、(4.08±2.65) ×103copy/ml，治疗 2 周后分别为(1.30 ±1.43) ×102、(0.95 ± 0.73) × 103copy/ml，P 均 ＜0.01。

3 讨论

肺炎支原体肺炎临床表现多不典型，早期不易作出诊断。血清学MP-IgM检查有一定的灵敏性、特异性，但特异性抗体高峰出现较晚，也有可能检出持久存在的MP-IgM抗体;另外，重症感染者可能不出现MP-IgM抗体，免疫功能低下的患者容易感染MP，感染后由于抗体产生不足、血清抗体不升高等原因，会造成免疫学检测无效，特别是婴幼儿，因而MP-IgM抗体检测不宜作为惟一的诊断方法。FQPCR具有PCR技术的DNA高效扩增、探针技术高特异性和光谱技术的敏感性及定量分析优点，在数小时内可以及时地提供结果，完全密封式操作可明显降低污染造成的假阳性，定量结果能够客观、适时地反映病情，故可作为肺炎支原体感染的早期诊断的有效方法［1］。

正常咽部极少有MP存在，故咽拭子MP检测阳性可为确诊提供保证［2］。另外幼儿咽部取样方便，年长儿童亦可取痰等呼吸道标本检查。本研究发现，荧光定量PCR法与微量颗粒凝集法在检测MP上无显著性差异;204例首次抗体＜1∶160的患儿中，35例患儿经微量颗粒凝集法对比双份血清后才能诊断，而采用荧光定量PCR法入院时32例即能诊断，提示荧光定量PCR法与微量颗粒凝集法相比具有早期诊断的特点。

支原体可引起支原体血症，直接侵犯各系统、组织引起病变［3］。国外报道从肺炎支原体呼吸道感染的病例血液中直接分离出肺炎支原体，提示肺炎支原体可进入血流，有在呼吸系统以外的部位增殖的可能性［4］。血PCR检查发现MP可以侵入血液，为MP肺外直接侵犯提供了依据，推测MP感染均有不同程度的血液侵入发生，若达一定程度，则能被灵敏的PCR技术检测出来。本研究血液标本PCR阳性率低于咽拭子标本，且MP-DNA平均拷贝值亦明显低于咽拭子，提示仅部分肺炎支原体侵入血液中，引起支原体血症。若依据血中MP的PCR检查为是否MP感染的依据，有可能造成对MP感染的漏诊，故不宜取血标本检查。本研究发现重症患者血液MP-DNA的拷贝数明显高于轻症者，急性期咽拭子和血液MP-DNA的拷贝数亦明显高于恢复期，证实MP-DNA的结果可用于判断病情、评估疗效、指导治疗。

综上所述，在MP感染急性期采用PCR法行咽拭子和血MP检测，能明显提高MP感染的阳性检出率;早期正确诊断和合理治疗可缩短住院时间和病程，减少并发症，降低治疗费用，而且，若结合血荧光定量PCR法MP-DNA的检测，对肺炎支原体肺炎病情判定及治疗效果评估具有很好的临床应用价值。

［1］孙红妹.肺炎支原体感染实验室诊断［J］.实用儿科临床杂志，2007，22(4):245-247.

［2］侯安存，刘玉华，辛德莉，等.健康儿童鼻咽部常见致病微生物携带状况及临床意义［J］.中华儿科杂志，2002，40(1):45-49.

［3］钟天鹰.荧光定量PCR法检测呼吸系统感染儿童肺炎支原体DNA 的分析［J］.临床儿科杂志，2002，20(3):137-139.

［4］Daxboeck F.Detection of Mycoplasma pneumoniae in serum specimens from patients with mycoplasma pneumoniae by PCR［J］.Int J Med Microbiol，2005，295(4):279-285.