饲料产品质量安全检测技术新进展

王金荣

饲料质量安全检测是采用一定的分析技术，对饲料产品质量及安全指标进行检测。其结果不仅是制定政策和标准的科学基础，同时也是解决贸易纠纷和行政监督的重要依据。发达国家在重视饲料法规的制定和实施，并且建立完整的饲料质量监督管理体系，对饲料产品的研制、生产、销售和使用等环节实行有效监督的同时，也十分重视饲料质量安全检测技术研究，对饲料质量安全等方面的问题进行有针对性的研究，及时制定相应的分析策略，为饲料安全有效监督提供技术支持。我国在借鉴国外先进技术基础上，饲料产品质量检测技术逐步提高，尤其是对饲料安全的检测和评价技术取得很大的发展。

由于饲料种类繁多且非常复杂，饲料中可能存在的化学、物理和生物的危害物种类纷杂不清，且含量极低，因此对饲料质量安全检测技术水平要求极高。尽管对饲料质量安全检测的分类方法不同，以对饲料中有害物质检测的逐级检测法进行分类包括筛选法、确证法和定量法。筛选法是用于大量样品的高通量分析，目的是为了检测某种或某类危害物质是否存在。该类方法的特点是简单、快速，不需要有特殊的场地和大型分析仪器及专门的技术人才，用于筛选分析的方法主要是基于生物学分析方法。确证法是对筛选法为阳性反应的样品做进一步检测，给出确信无疑的结论或结果，通常以质谱分析为主。定量法是对待测物质进行定量的结果，也是贸易、仲裁等主要依据，尤其是对限量的药物、添加剂或其他危害物的定量测定。我国大部分饲料检测方法标准还是以定量分析为主，主要应用的技术是紫外-可见分光光度计法、原子吸收法、原子荧光法、液相色谱、气相色谱方法等等。根据分析方法不同，可以将饲料质量安全检测技术分为化学检测和生物学检测，本文将分别对化学检测和生物学检测进行综述。

1 化学检测技术

化学检测技术主要是应用各类分析仪器，采用化学的方法完成分析检测任务的一种分析方法，也是常用的检测技术。

1.1 光谱分析技术

饲料分析中的光谱技术主要是对饲料中金属元素及其形态的检测，包括原子吸收光谱、原子荧光光谱和电感耦合等离子体发射光谱技术，及通过对饲料中有机组分进行检测的近红外光谱技术。原子吸收光谱分析在饲料中广泛应用，主要是对饲料中金属元素总量进行检测，如饲料中的铜、锌、铁、锰、钴、镍、钠、钾、钙、铝、硒等金属元素的检测（于青，1995；宁正祥，1998；王加启等，2004）。有些已经制定为国家或行业的标准方法，如动物饲料中铁、铜、锰、锌、镁的测定方法（GB/13885—2003）、饲料中钴的测定方法（GB/13884—2003）等已被广泛采用。原子荧光法的分析对象与原子吸收和原子发射光谱法相同，原则上可以进行数十种元素的定量分析。但迄今为止，原子荧光光谱法最成功的应用还是易于形成气态氢化物的10种元素（As、Sb、Bi、Se、Ge、Pb、Sn、Te、Cd、Zn）和 Hg。孙德辉（2002）采用原子荧光测定了饲料中的总砷、汞，取得满意的结果。王金荣等（2009）采用氢化物发生-原子荧光光谱法对饲料通过消化罐消化的方式，一次样品预处理，同时检测砷、汞、硒和镉四种元素得到很好的回收率和精密度。丁红梅等（2004）、付佐龙等（2009）探讨了应用原子荧光光谱法检测饲料中镉。陈新焕等（2003）对饲料中的微量汞用原子荧光光谱检测均得到理想的分析结果。随着我国原子荧光仪器的技术水平的提高，饲料中的硒、镉、汞、砷等元素的检测灵敏度及准确度均得到提高，有些已经被制定或已列入国家标准制定计划中，如饲料中镉、硒、砷的原子荧光方法检测。原子发射光谱在20世纪50年代就开始在我国推广和普及，特别是在地质、冶金、机械等部门得到了广泛的应用，并建立了国产的原子发射光谱仪器生产基地，仪器类型主要以火焰光度计为主。20世纪70年代迅速兴起的电感耦合等离子体发射光谱（ICPAES），既保留了原子发射光谱同时分析的特点，又具有溶液进样的灵活性与稳定性，使原子发射光谱进入一个新的发展阶段。目前电感耦合等离子体发射光谱主要用于饲料中金属元素的分析，因为仪器的普及程度不如其他两种类型的仪器，因此在制定标准时很少采用。对饲料中金属元素的检测除应用光谱分析技术外，Mahesar等（2010）应用微分脉冲阳极溶出伏安法（DPASV）检测28中不同商业家禽饲料中的锌、镉、铅和铜，检出限分别为 0.69、0.35、0.68 和 0.24 μg/kg。

近红外技术检测的原理是饲料中的分子物质可以吸收不同波长的光，根据对饲料有机组分中含有的C-H、N-H、O-H等化学键的泛频振动或转动，以漫反射方式获得在近红外区的光谱信息，通过与仪器的数据库或待测组分线性及非线性模型进行分析。优点是检测快速，不用有害的试剂，所需的样品量少，非破坏性的无损检测。近年来近红外光谱技术在饲料原料检测中推广应用，可以用来对饲料中有机组分如水分、粗蛋白、脂肪等进行快速检测。在青贮饲料的品质测定中，应用近红外光谱测定饲料的pH值、粗蛋白、粗灰分、干物质等指标，得到很好的结果，但对于可溶性碳水化合物含量的粗略估计，精度有待提高（李宇萌等，2010）。我国也制定了饲料中水分、粗蛋白、粗纤维、粗脂肪、赖氨酸和蛋氨酸的近红外快速测定方法（GB/T18868—2002）。由于该项技术是间接的检测，需要大量的样品参考值来建立校正和参考模型。同时受饲料资源的近红外光谱数据库的限制，在某种程度上限制了该技术在饲料检测上的应用。尤其是对于配合饲料和浓缩饲料，由于其成分复杂，很难用近红外对其中的某种成分进行准确检测。

此外，高光谱分析技术在肉骨粉尤其是反刍动物源性饲料的检测中，开始研究应用。应用高光谱分析对包含有朊蛋白饲料样品的检测，已经建立了分析数据系统或模型。Nansen等（2010）建立了包含3.65×106的高光谱分析数据系统，其中有1.15×106份数据来自肉骨粉样品，2.23×106来自12种其他饲料原料，光谱范围是419～892 nm，用这种高光谱检测动物源性饲料可以作为定性分析，用这种方法可以检测饲料中添加1%（重量百分比）的肉骨粉，方法简单灵活，易于控制饲料的质量。

1.2 色谱分析技术

色谱分析的基本原理是让混合物通过互不混溶的两相，由于各组分的结构、性质不同，因此可以在两相中进行分离。饲料检测中应用的色谱仪器主要有气相色谱仪和液相色谱仪。

我国国家标准中规定的饲料中农药残留如有机磷（GB/T18969—2003）、除虫菊酯类（GB/T19372—2003）、氨基甲酸酯类（GB/T19373—2003）等大多数农药残留的检测均采用气相色谱分析方法。随着饲料中油脂的添加，对油脂质量及种类的检测逐渐成为关注的重点，因此开始应用气相色谱对饲料中脂肪酸种类及含量进行检测，以确定饲料中油脂的组成。此外饲料香味剂的检测主要包括对其香气、理化指标、稳定性和有效性等进行检测，由于香味剂是非常复杂的化合物，在国外多采用气相色谱－质谱联用技术进行定性定量分析。我国对香味剂的碱性主要是对其中味料部分的一些成分进行检测，如谷氨酸钠、肌苷酸、鸟苷酸、糖精钠、葡萄糖等采用高效液相色谱方法进行检测；对于香气部分如含有丁酸乙酯、乳酸乙酯、香草醛等成分采用气相色谱进行检测。饲用防霉剂目前国内外普遍采用气相色谱或高效液相色谱方法进行检测，有些方法直接采用食品添加剂检测标准方法，例如饲用防霉剂中的脂肪酸类物质，包括甲酸、乙酸、丙酸、山梨酸、苯甲酸等采用气相色谱技术，用有机溶剂丙酮/石油醚等提取，经过离心净化，通过色谱柱或毛细管柱的分类，用电子捕获、氢焰等检测器进行定量测定。饲用抗氧化剂是添加到饲料中，能够阻止饲料或延迟饲料氧化，提高饲料稳定性和延长贮存期的一类物质，常用的有乙氧基喹啉、二丁基羟基甲苯（BHT）、丁基羟基茴香醚（BHA）等。对于抗氧化剂的检测技术多采用高效液相色谱或气相色谱技术进行分析。如饲料中BHA、BHT的检测采用液相色谱技术，经乙烷溶解提取、乙腈萃取浓缩，异丙醇稀释后注入高效液相色谱仪中进行分离检测，用紫外检测器进行定量分析。乙氧基喹啉、BHT也可以采用气相色谱方法，经毛细管柱分离，用氢焰检测器测定其含量。

液相色谱在饲料检测中的应用十分广泛，例如饲料中维生素的反相高效液相色谱分析方法已经列为国家标准分析方法。氨基酸的检测从以氨基酸分析仪为主逐步转向普遍采用的高效液相色谱方法：经邻苯二甲醛（OPA）和异硫氰酸苯酯（PITC）柱前衍生后，经C18柱分离，紫外或荧光检测器进行检测。该方法的分析时间短，灵敏度高，极易在大中型饲料厂中普及应用。液相色谱还广泛应用于饲料中药物的检测，随着国家对饲料安全问题的重视，饲料标准化委员会组织制定了大批饲料中违禁药物的检测方法，如饲料中盐酸克伦特罗、呋喃唑酮、磺胺喹恶啉、磺胺二甲基嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、盐酸氯苯胍等，饲料中西马特罗、地西泮、苯巴比妥、氯丙嗪、己烯雌酚、雌二醇、玉米赤霉烯酮、氢化可的松、氯霉素、金霉素、土霉素、氯苯胍、喹乙醇、莫能菌素、拉沙络西钠、杆菌肽锌、氯羟吡啶、尼卡巴嗪、盐霉素、林可霉素、百里霉素、盐酸氨丙啉、二甲硝咪唑等等，大部分采用液相色谱或液相色谱－质谱联用技术进行分析。此外，也进行了一些饲料中药物尤其是违禁药物的分析研究工作，如Wang等（2010）通过固相萃取等净化技术，对饲料中硝呋烯腙进行液相色谱分析，检出限达到0.05mg/kg，定量限为0.2mg/kg。对饲料中多种药物的同步检测分析是现今饲料分析技术的主流方向之一。Shen等（2009）应用高效毛细管电泳测定了饲料中5种苯并咪唑类药物，检出限低于2mg/kg，所有药物的回收率均大于73%，变异系数低于10%。Galarini等（2009）应用液相色谱荧光检测器和紫外检测器检测了饲料中的11种喹诺酮类药物，检出限为0.04～0.8mg/kg，回收率为69%～98%，变异系数低于10%。Driver等（2009）用柱后衍生离子交换色谱荧光检测了饲料中的新霉素B和新霉素C，在治疗剂量的饲料产品中新霉素含量范围为50%～0.005%（质量比，以新霉素为基础计）时，新霉素B平均回收率是100.4%，变异系数2.28%，新霉素C的回收率是97.5%，变异系数4.36%，均有良好的分析效果。

应用液相色谱对饲料调质剂的检测分析逐渐推广。饲料调色剂或者着色剂有天然提取的色素和人工合成色素，主要采用液相色谱仪器进行定量分析。如饲料中叶黄素的检测，目前精确测定的最可靠方法是高效液相色谱方法，根据1984年美国公职分析化学家协会（AOAC）提出柱层析色谱法测定总叶黄素，直接用分光光度计进行检测。我国2008年上半年出台了饲料添加剂叶黄素检测的国家推荐标准GB/T21517—2008，比柱层析方法更加简单，操作步骤少，大大提高了叶黄素检测工作的推广。

1.3 质谱技术

确证分析是针对一些未知分析目标物，通过对质谱库比对等进行未知物的确定。确证法可以应用多种技术，如高效液相色谱方法、气相色谱方法、色谱－质谱联用技术等，尤其是质谱联用技术的应用，使得在检测微量危害物和残留物方面发挥了重要的作用。我国在对“瘦肉精”专项查处工作中，采用的检测技术方法是应用液相色谱－质谱联用技术对样品进行定性、定量分析，对饲料安全的监督具有保障作用。

各种分析技术联用是现代分析发展的特点，联用技术即可进行分离，同时又可对目标物进行定性和定量，因此在确证分析中得到广泛的应用。饲料分析中常见的联用技术有气相色谱－质谱联用技术（GCMS）、液相色谱－质谱联用技术（LC－MS）、液相色谱－电感耦合等离子体光谱－质谱联用技术（LC－ICP－MS）等。Wang等（2010）应用HPLC－ICP－MS检测了饲料添加剂有机砷和饲料中的阳离子砷，很好地分离检测了洛克沙砷、阿散酸、砷酸、亚砷酸、一甲基砷、二甲基砷、4－羟基苯砷酸7种砷，砷最低检出量能达到1.7 μg/kg，7种形态砷的回收率大于78.5%。Wang等（2006）应用HPLC－MS对饲料中呋喃唑酮、呋喃他酮、呋喃西林和硝呋烯腙进行检测，优化分离条件，实现对四种呋喃类药物的同步检测。对饲料中镇静剂的同步检测已经列为我国农业部标准：饲料中盐酸异丙嗪、盐酸氯丙嗪、地西泮、盐酸硫利达嗪和奋乃静的同步测定－高效液相色谱法和液相色谱质谱联用法（NY/T 1458—2007）。采用液相色谱－电喷雾离子井（LC/ESI－MS/MS）检测饲料中的莫诺霉素，检测实验室制备样品的含量范围是0.50～30.0 μg/g，回收率为83.9%～94.2%，相对标准变异小于 23%，定量限 0.1 μg/g（Gallo 等，2010）。Delahaut等（2010）利用 HPLC－MS/MS检测饲料中拉沙洛西钠、盐霉素钠、沙利霉素钠等11种抗球虫药物钠盐，实验室检测目标含量低于欧盟标准。Zhang等（2009）采用LC－MS同步检测饲料中违禁药物沙丁胺醇、莱克多巴胺和克伦特罗，在添加剂量为 0.5～500mg/kg含量范围内，回收率为83%～110%，变异系数为1.5%～11%，该方法的检出限和定量限分别为0.01和0.05mg/kg。Kantiani等（2010）应用液相色谱－电喷雾串联质谱（SPE－LC－ESI－MS－MS）同步检测饲料中18种抗生素，包括青霉素类、先锋霉素类和磺胺类药物，定量限达到0.25～5.79 mμg/kg。

关于对饲料中添加药物尤其是违禁药物的色谱－质谱联用技术的研究成果很多，并且还在不断的研究发展中。由于这些联用技术需要的大型仪器价格昂贵，使用成本高，并且需要特殊的场地和专门的人才，因此限制其在饲料监督过程中的广泛应用。

2 生物技术在饲料检测中的应用

应用生物学检测方法目前已经成为饲料安全检测中重要的技术之一，特别是免疫学检测方法，几乎是快速筛选的主要技术，作为一种新型的分析技术手段已经渗透到安全分析的其他环节。

2.1 免疫学方法

免疫学方法是在特异性抗体－抗原反应原理基础上建立的，在20世纪初被用来进行肉的种类的鉴别，主要有酶联免疫法（ELISA）、放射免疫法（RIA）和免疫荧光法（FIA）。现在已有多种试剂盒被研发出来，用于饲料中违禁药物如盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、地西泮、沙丁胺醇、氯丙嗪、四环素、呋喃类药物等。同时对饲料中动物源性成分如肉骨粉、反刍动物成分等进行检测。由于免疫分析技术是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析技术，因此具有极高的选择性和灵敏性，具有操作简单、样品容量大、仪器化程度高和分析成本低等优点，是目前理想的饲料中违禁药物筛选的方法之一。

此外，酶联免疫法用于霉菌毒素的测定研究取得新的进展，现已经研究并建立了黄曲霉素B1、赭曲毒素A、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆抗体酶联免疫方法，利用酶联免疫药盒可以快速测定饲料原料和成品饲料中霉菌毒素污染状况，为防霉保鲜和防霉剂的使用提供依据。

Jiménez等（2010）应用酶联免疫方法检测饲料中的磺胺类药物。Shiu等（2010）建立了灵敏的检测谷物饲料及饲料产品中伏马菌素B1。完全竞争酶联免疫法检测商业饲料中的重组牛生长激素，在20～500 μg/g有良好的线性关系，相关系数大于0.98，日内和日间的变异系数为3.4%和5.3%，并且添加回收率为105%。Li等（2009）应用酶联免疫法检测饲料中的四种呋喃类药物，检出限为0.2～2.1 ng/g，平均回收率为75.9%～86.4%。Zhao等（2008）应用单克隆抗体酶联免疫法碱性饲料中的喹乙醇，与液相色谱检测方法有很高的相关性。

2.2 以检测DNA为基础的方法

以DNA为基础的检测技术主要有核酸探针杂交、DNA指纹分析、PCR－RELP分析、PCR特异扩增（常规PCR方法和Real－time PCR方法）。主要原理都是对各种物种内特异的核酸序列进行提取、鉴定，从而判定饲料内有无该物种的成分。其中PCR特异扩增方法由于其简单、快速、特异性强的特点，成为目前最广泛应用的方法，特别是荧光PCR的应用使得检测的特异性和敏感性更高。我国也于2008年4月1日颁布实施了应用PCR方法定性检测动物源性饲料中动物成分的标准，包括骆驼源性成分、狗源性成分、哺乳动物源性成分、猪源性成分、兔源性成分、鹿源性成分和马、驴源性成分的PCR定性检测，为进一步规范和监督动物源性饲料的安全使用提供技术支持。

Cawthraw等（2009）应用实时PCR测定动物饲料中禁用的哺乳类及禽类成分，饲料中含有1%的肉骨粉时检测其中的16S rRNA可以进行鉴别。用mtATP6作为靶序列，应用PCR探针技术检测饲料中的猪源成分，以PPA8和PPA6作为检测DNA，检出限可以分别达到0.01%和0.001%，这种方法已经在日本的饲料检测中应用（Shinoda等，2008；Yoshida等，2009）。

2.3 微生物的检测

饲料中污染微生物的危害主要产生在以下四个方面，一是含有致病性微生物如沙门氏菌、志贺氏菌、致病性大肠杆菌等而使动物产生疾病；二是微生物的繁殖使某些营养成分如脂肪、动物蛋白产生腐败作用；三是非致病性微生物寄生于饲料中，消耗饲料中的养分，使饲料营养价值下降；四是某些微生物会产生毒素如黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、肉毒毒素、金黄色葡萄球菌肠毒素等，动物食用含有这些毒素的饲料后会产生危害。目前微生物的检测技术发展很快，利用了包括微生物学、分子化学、生物化学、生物物理、免疫学和血清学等领域的知识，其目的是建立可用于微生物计数、早期诊断、鉴定等方面的快速检测技术。除常规的平板培养外，目前已有商品化的基因探针试剂盒，如 GENE－TRAK Systems DNA杂交筛选法（AOAC方法：987.10，990.13）。李斯特氏菌、沙门氏菌、弯曲杆菌等均有DNA探针的试剂盒。目前，已经有了全自动化的PCR检测试剂盒及仪器，如美国杜邦快立康公司的BAX病原菌检测系统。可用于检测沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7等致病菌。荧光酶免疫分析筛选方法是在EIA基础上加入荧光标记的酶底物，用荧光计检测荧光度值来判断结果。如沙门氏菌荧光酶免疫分析研究筛选方法是基于EIA测定沙门氏菌抗原。沙门氏菌多克隆免疫色度分析筛选方法已有许多试剂盒，由澳大利亚Bioenterrises Pty Ltd和美国BioControl Systems，Inc研制的多克隆免疫试剂盒，都已获 AOAC认可。Koyuncu等（2010）建立了以PCR为基础的商业化沙门氏菌enterica检测，当每25 g饲料中含有1个沙门氏菌enterica时的检测结果与培养法相近，该方法与平板培养的灵敏度及专属性基本一致。但也会有一些PCR检测阳性的饲料中并不能分离出沙门氏菌，因此PCR方法目前还不能完全替代平板培养法，但可以用来进行流行病学调查研究的方法。

3 饲料检测技术的未来发展方向

针对饲料工业快速发展的需要，尤其是高新技术产品及饲料、营养研究的最新进展需要开展相应的“快”、“高”、“难”检测技术的研究。在饲料样品预处理方面，现代分析样品制备技术的发展趋势就是使处理样品的过程要简单、处理速度快、使用装置要小、引进的误差要小、对欲测定组分的选择性和回收率要高。目前，国际上较多使用固相萃取(SPE)、微波提取技术、凝胶层析(GPC)、加速溶剂提取（ASE）、基体分散固相萃取（MSPD）、超临界萃取（SFE）、固相微萃取技术。而我国目前主要采用传统的溶剂萃取，液液分配，柱层析净化，前处理方法自动化程度低、提取净化的效率不高，速度慢，环境污染严重。新开发的前处理技术其目的和结果就是要实现快速、有效、简单和自动化地完成分析样品制备过程。在仪器设备方面，要求检测仪器自动化程度进一步提高，色谱分析柱通用性强，朝更高灵敏度、更高选择性、更方便快捷的方向发展，不断推出新的方法来解决遇到的新的分析问题。

此外，应进一步开展针对饲料中违禁药物、霉菌毒素等有毒有害物质的高通量筛选技术和快速检测技术的研究，开展对转基因饲料中外源基因的筛查及定性分析技术及微生态制剂的质量检测技术和安全评价技术的研究等。

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