快速右房起搏制备猪房颤模型及其心肌组织中抗凝血酶测定的研究

李 飞，张卓琦，张超群，徐 晤，王志荣*

(1徐州医学院研究生部，江苏徐州221004;2徐州医学院附属医院)

房颤(AF)是临床上最常见的一种心律失常，总发病率约0.89%，其中＞60岁年龄组发病率约为5.9%［1］。栓塞是AF最重要的并发症［2］，原因为心房内附壁血栓形成，但机制尚不明确。2008年10月，我们采用快速右房起搏法制备猪AF模型并采用质谱法(MALDI-TOF MS/MS)［3］对猪心肌组织中抗凝血酶表达进行了测定，旨在为进一步治疗AF提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 健康家猪12只，年龄2～3个月，雌雄不拘，体质量(37.4±2.5)kg，随机分为模型组和对照组各6只;Protein IEF cell型等电聚焦仪、ProteinⅡⅪcell型垂直电泳槽、GS-800光密度扫描仪;埋藏式高频率起搏器(南京医科大学);“J”形锚状心房单极电极;固相pH梯度干胶条(IPG dry strip，pH值4～7、17cm)，乙二胺四乙酸(EDTA)，四甲基乙二胺(TEMED)，丙基硫酸盐(CHAPS)。

1.2 AF模型制备及鉴定 ①模型制备:参考Chen等［4］快速右房起搏法并加以改良。两组均以3%戊巴比妥钠麻醉，采用Seldinger血管穿刺技术穿刺右侧颈内静脉，模型组植入心房单极起搏电极，用起搏分析仪测量起搏参数(电压阈值＜1 V，阻抗500～1 000 Ω)，满意后将电极尾端与高频心脏起搏器相连，体外磁铁设定参数:起搏方式为AOO，脉冲频率520次/min，脉冲幅度≥5 V，脉冲宽度0.15 ms，测试满意后埋置起搏器。对照组仅植入电极，不予起搏。两组术后均常规抗感染4 d。②鉴定:AF模型制备前及制备2周后，分别采用程序刺激对两组行电生理检查，其中程序刺激驱动周长(S1S1)为300 ms，S1S2间期为心房有效不应期+50 ms，步长5 ms反扫直至不应期;不能诱发AF时引入S3，S2S3间期从S1S2的80%开始，步长5 ms反扫直至S3落入不应期;仍不能诱发AF时引入S4;S4未能诱发AF时，采用12 Hz、脉宽2 ms、4倍阈值的Burst(500次/min)刺激诱导。模型组经以上诱发刺激出现AF者为制模成功［5］，并进入下列实验。

1.3 猪心肌组织中抗凝血酶测定①心肌组织分离及处理:两组均于心脏电生理检查结束后迅速开胸，取出心脏置于冰块上，生理盐水洗静血液，分别剪取心房、心室及室间隔组织，分装到EP管后置于液氮瓶中冻存24 h，转至-20℃冰箱保存。②双向电泳及银染色:参照Lai等［6］方法及Bio-Rad操作手册。自冰箱取水化上样缓冲液I，置室温溶解后在试管中加入0.01 g DTT，Bio-Lyte 4～6、5～7各2.5 μl，充分混匀。取出400 μl水化上样缓冲液，加入300 μg样品，混匀后线性加入水化盘，置入IPG胶条，覆盖2～3ml矿物油。将聚焦IPG胶条二次平衡后从样品水化盘中移出，浸在1×电泳缓冲液中，放置5min后进行SDS-PAGE垂直电泳，溴酚蓝指示剂达到底部边缘时停止电泳(每个样品重复3次)，通过固定、敏化、硝酸银染色、显影、停显及脱色，至背景清晰。③图像分析及质谱鉴定:采用GS-800对上述银染凝胶进行扫描，用PD-Quest TM软件对图像进行背景消减、蛋白质点匹配和校正，获取蛋白质点的位置坐标和表达量分析。选取斑点体积差异比值大于≥60且最优离子积分≥30的差异蛋白点，切取后低温保存送复旦大学分鉴定，采用GPS Explore Workstation-MASCOT检索NCBInr蛋白数据库(http://www.matrixscience.com)寻找匹配的相关蛋白质。

1.4 统计学方法 采用SPSS16.0软件行统计学处理。计量资料用±s表示，组内、组间比较均使用t检验;P≤0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 AF模型制备情况 两组术前行电生理检查时均未诱发出AF。模型组快速起搏2周后关闭起搏器时1只猪出现AF，余5只猪经程序刺激或Burst刺激均可诱发出AF，AF持续时间(26.41±9.89)min;对照组AF诱发情况较术前无变化。

2.2 猪心肌组织中抗凝血酶表达 银染后PDQuest TM软件计算结果显示两组有意义靶点编号为3708，模型组和对照组平均灰阶度分别为47.4、445.9(P＜0.05);靶点蛋白质谱鉴定为抗凝血酶(其蛋白质积分为254、最优离子积分为59、标志性肽段为3)。

3 讨论

由于AF发病机制仍未完全阐明，治疗效果一直不尽理想，故建立理想的AF模型、深入研究AF发病机制具有重要临床意义。20世纪90年代初，Allessie等［7］采用心外膜方法建立了慢性持续性AF动物模型，郑方胜等［8］采用快速心房起搏法建立了兔AF模型，但其AF持续时间短、诱发率低、可重复性差。鉴于猪性格温和，心脏形态、内部结构、血管配置均与人心脏相似，故本研究选择猪作为实验动物。AF有较高致残率，Kannel等研究表明阵发性AF患者年中风率为11.3%。AF容易形成心房内附壁血栓，后者脱落可导致体循环栓塞等严重并发症，但其血栓形成机制尚不十分明确;Motoki等［9］认为AF患者左心房中凝血活性增高，即使在不发作时期仍存在凝血高风险。抗凝血酶属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族，相对分子质量为58 kU，由432个氨基酸组成，主要作用为抑制凝血酶和因子Xa，对Ⅺa、Ⅻa因子及纤溶酶、激肽释放酶亦有抑制作用。研究显示，抗凝血酶活性降低与心脑血管内血栓形成有一定相关性［10］，可能机制为引起凝血酶灭活减少、凝血功能亢进。

本研究显示，植入心脏起搏器、快速心房起搏2周后，采用程序刺激或Burst刺激后均诱发出AF，证明此制模方法稳定可靠。通常认为抗凝血酶由肝脏和内皮细胞合成。本研究显示，模型组右房心肌组织中抗凝血酶表达显著低于对照组。可能机制:模型组右房组织中内皮细胞功能受损导致抗凝血酶合成减少;其他未探明因素使抗凝血酶消耗增多。本研究未能分离心肌细胞与内皮细胞，有关抗凝血酶的具体表达位置将在今后使用其他生物学方法进一步探讨。

综上所述，快速右房起搏法制备猪AF模型稳定可靠;AF易并发血栓形成的可能机制为其心肌组织中抗凝血酶表达降低。

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