16S rRNA甲基化酶导致的氨基糖苷类抗生素高水平耐药研究进展

余方友

(温州医学院附属第一医院检验科，浙江温州 325000)

氨基糖苷类抗生素可以治疗革兰阳性球菌和革兰阴性杆菌引起的感染，由于氨基糖苷类抗生素具有耳和肾毒性，在临床上的应用受到一定的限制。氨基糖苷类抗生素具有浓度依赖性快速杀菌作用、与β-内酰胺类抗菌药物可产生协同作用、细菌的耐药率低、抗生素后效应较长等优点，它仍是目前临床常用的药物，广泛用于治疗革兰阴性杆菌所致的严重感染。在治疗严重感染时，特别是由多重耐药菌株引起的严重感染时，单独使用氨基糖苷类抗生素治疗时可能疗效不佳，常需联合应用其他对革兰阴性杆菌具有强大抗菌活性的抗菌药物，如第三代头孢菌素及氟喹诺酮类药物等。

氨基糖苷类抗生素的使用同样面临着耐药问题，近年来，细菌对氨基糖苷类抗生素的耐药率不断上升。细菌对氨基糖苷类抗生素产生耐药的机制主要由细菌产生氨基糖苷类药物钝化酶引起，如N-乙酰基转移酶、O-磷酸转移酶及O-腺苷转移酶[1-4]。氨基糖苷类抗生素修饰酶能够催化氨基糖苷抗生素的氨基或羟基共价修饰，导致氨基糖苷类抗生素与核糖体的结合减少从而导致耐药。这些修饰酶通常只作用一种或几种结构类似的抗生素，不能灭活所有的氨基糖苷类抗生素，如阿米卡星[4]。近年来，发现一类质粒介导的16S rRNA甲基化酶，该酶能够保护细菌的30S核糖体16S rRNA不被氨基糖苷类抗生素结合，造成对包括阿贝卡星在内的所有氨基糖苷类抗生素耐药，并且为高水平耐药[5-8]。本文就16S rRNA甲基化酶导致的氨基糖苷类抗生素高水平耐药机制的研究进展进行综述。

1 16S rRNA甲基化酶的作用机制

近年来，革兰阴性杆菌的核糖体16S rRNA的甲基化已成为一种对氨基糖苷类抗生素产生耐药的新机制。革兰阴性杆菌的核糖体30S亚基的甲基化是由新发现的16S rRNA甲基化酶所导致，该酶类似于产氨基糖苷类抗生素的放线菌产生的物质。16S rRNA甲基化酶导致革兰阴性杆菌对目前临床上使用的氨基糖苷类抗生素高水平耐药，该酶的编码基因通常位于可转移的质粒上，具有进行水平播散的潜力，导致携带16S rRNA甲基化酶基因的菌株在全世界范围内快速传播，给临床治疗造成非常大的困难。16S rRNA甲基化酶特异性地结合核糖体30S亚基氨基酸位点 (A位)，从而干扰蛋白质的合成。

氨基糖苷类抗生素是由放线菌产生，如链霉菌和小单孢菌属。这些放线菌对氨基糖苷类抗生素具有天然的抗药性[9]。在许多情况下，这种抗药性的形成是由于核糖体蛋白对16S rRNA基因的A位点上特定核苷酸进行甲基化，妨碍氨基糖苷类抗生素结合到30S核糖体亚基，以免遭到自身产生的氨基糖苷类抗生素的攻击。产氨基糖苷类抗生素的放线菌对氨基糖苷类抗生素的天然耐药是一种自我保护的方式，这种保护机制被认为不存在于临床相关的其它菌种中。然而，2003年在铜绿假单胞菌临床分离株中发现了质粒介导的16S rRNA甲基化酶，导致对临床上重要的氨基糖苷类抗生素高水平耐药，如阿米卡星、丁胺卡那霉素、妥布霉素和庆大霉素等[7]。自2003年以来，关于这个新出现耐药机制的研究报道快速增加，世界各地报道了有关16S rRNA甲基化酶的分布及其基因型。

1.1 细菌rRNA的修饰

核糖体是由多种酶蛋白和RNA组成的大分子物质，在细菌中，它是由30S和50S的两个小亚基构成，前者包含16S rRNA，后者包含23S和5S rRNA。RNA转录后的修饰，如核苷酸甲基化，发生在RNA转录之后。以前报道的主要是tRNA转录后的修饰，但也有rRNA修饰的报道。rRNA甲基化的主要作用可能包括调节rRNA的成熟、稳定rRNA的结构、以及改变翻译的速率，例如，大肠埃希菌突变体产KsgA(RsmA)不足，则会增加无义突变和移码突变，最终改变了16S rRNA基因 A位和肽-tRNA解码的保真度[10，11]。此外，某些转录后发生的甲基化会导致抗生素靶位rRNA基因的抗药性。

1.2 放线菌中16S rRNA甲基化介导的耐药性

大量的放线菌对自己产生的氨基糖苷类抗生素具有天然的耐药性，其机制为产生氨基糖苷类修饰酶来灭活氨基糖苷类抗生素和通过产生16S rRNA甲基化酶保护16S rRNA上的30S核糖体亚基导致氨基糖苷类抗生素不能与30S核糖体亚基结合。16S rRNA甲基化酶可导致对多种氨基糖苷类抗生素高水平耐药。这是一个有效的手段来避免由于自身产生的物质抑制自身的蛋白质合成作用，并且在产氨基糖苷类抗生素的放线菌中广泛存在[12]。

已经确定16S rRNA基因两个位点的甲基化可导致氨基糖苷类抗生素不同的耐药表型[13]，其中一组16S rRNA甲基化酶在A1408位点进行甲基化，如产异帕米星的链霉菌[14]；另一组16SrRNA甲基化酶在G1405位点进行甲基化，如产庆大霉素的紫色小单孢菌。16S rRNA基因A1408位点的甲基化导致对卡那霉素和安普霉素耐药，但对庆大霉素敏感；16SrRNA基因G1405位点的甲基化导致对卡那霉素和庆大霉素耐药，但对安普霉素敏感。这些甲基化产物位于16S rRNA基因A位点解码区，氨基糖苷类抗生素可结合到该位点，通过阻断肽基-tRNA从A位到肽酰-tRNA位点的移位来干扰准确的翻译[15]。

1.3 16S rRNA甲基化酶介导的革兰阴性菌耐药性

ArmA型16S rRNA甲基化酶的编码基因在法国分离的一株肺炎克雷伯菌中被发现，ArmA蛋白对4，6取代的去氧链霉菌类抗生素高水平耐药[6]。在2003年，日本报道一株铜绿假单胞菌临床分离株由于产16S rRNA甲基化酶导致对氨基糖苷类抗生素高水平耐药，该新出现的蛋白酶被命名为RmtA，与各种放线菌产生的16S rRNA甲基化酶具有中等的相似性，相似度为35%[7]。RmtA在一株氨基糖苷类抗生素敏感的铜绿假单胞菌中使16S rRNA 30S亚基核糖体发生甲基化。当rmtA基因克隆在大肠埃希菌和铜绿假单胞菌中表达时，发现它的表达产物对所有4，6取代的去氧链霉菌类抗生素高水平耐药，包括庆大霉素、妥布霉素和阿米卡星。16S rRNA甲基化酶的编码基因与放线菌产生的甲基化酶基因只有中等的同源性，介于30%和35%之间。RmtA的结构基因与一段基因序列有关，该序列类似于一段位于可转移的质粒上对汞耐药的转座子Tn5041的序列[16]。rmtA胞嘧啶和鸟嘌呤的含量为55%，表明它起源于一些胞嘧啶和鸟嘌呤含量丰富的微生物，包括放线菌。ArmA的结构基因被报道位于具有复合功能的转座子Tn1548中，ArmA的结构基因胞嘧啶和鸟嘌呤的含量为30%，表明它起源于某些胞嘧啶和鸟嘌呤含量较低的微生物[17]。这些研究结果表明，16S rRNA甲基化酶的编码基因可能从环境中非致病微生物通过水平传播获得，但其确切的起源尚不清楚。

迄今为止，共发现了7种16S rRNA甲基化酶，分 别 为 ArmA、RmtA、RmtB、RmtC、RmtD、RmtE 和NpmA。RmtB在日本分离的粘质沙雷菌中被发现[5]，RmtB与RmtA同源性最高，在氨基酸水平具有82%的同源性。RmtB的编码基因位于毗邻Tn3类转座子的可转移大质粒上。RmtC是在日本分离的变形杆菌临床菌株中发现的，与已经报道的ArmA、RmtA和RmtB具有较远的遗传系统史[18]，RmtC的结构基因位于靠近一个转座子介导的被称为ISEcp1的重组序列，且该甲基化酶基因可以在质粒之间进行转移[19]。最近发现的16S rRNA甲基化酶RmtD，与RmtA和RmtB具有40%～42%的同源性[20]。RmtD是在巴西分离的一株铜绿假单胞菌中发现的，它同时产SPM-1型金属-β-内酰胺酶，导致该菌株同时对碳青霉烯类和氨基糖苷类抗生素高水平耐药[20]。2007年，从日本分离的一株大肠埃希菌中发现另一个新的16S rRNA甲基化酶，NpmA，该酶与链霉菌属的KamA甲基化酶的同源性较低，只有30%，该酶可以导致阿米卡星、庆大霉素、新霉素、核糖霉素等耐药[21]。最近，在牛体内分离的大肠埃希菌中又发现了一种16S rRNA甲基化酶，RmtE[12]。这些在革兰阴性杆菌中新发现的16S rRNA甲基化酶基因，导致细菌对所有4，6取代2-去氧链霉菌类抗生素高水平耐药，包括庆大霉素、妥布霉素和阿米卡星，但不包括4，5取代2-去氧链霉菌类抗生素，如新霉素，4取代-去氧链霉菌类，如巴龙霉素或链霉素。最近，研究发现30S核糖体亚基的16S rRNAG1405位点的甲基化由ArmA所介导[22]，而NpmA可以对30S核糖体亚基的16S rRNA G1408位点N-1进行甲基化[21]。

2 16S rRNA甲基化酶介导的耐药在临床分离株中的流行情况

关于革兰阴性杆菌通过16S rRNA甲基化酶介导的氨基糖苷类抗生素耐药的数据仍然较少。在日本、中国台湾、韩国、中国和比利时分离的肠杆菌科细菌中均检测到RmtB型16S rRNA甲基化酶基因，包括肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、大肠埃希菌和弗氏枸橼酸杆菌。ArmA最初在弗劳地枸橼酸杆菌中发现，随后在肺炎克雷伯菌中发现。在东亚、东欧和西欧多个国家分离的临床分离株中发现ArmA，包括大肠埃希菌、粘质沙雷菌、阴沟肠杆菌、沙门菌、志贺菌和不动杆菌属等。尽管在多个地区分离的革兰阴性杆菌临床分离株中检测出16S rRNA甲基化酶，但这些酶的检出率比较低。日本分离的铜绿假单胞菌临床株中RmtA检出率较低，为0.4%[7]；2004年台湾分离的肺炎克雷伯菌ArmA和RmtB的阳性率只有0.4%和0.04%[8]；韩国在一次调查中只发现一株高度耐阿米卡星的肺炎克雷伯菌携带rmtB基因[23]；在比利时分离的肠杆菌科细菌中找到ArmA和RmtB型16S rRNA甲基化酶，但在肺炎克雷伯菌中没有找到RmtB[24]。有研究表明，北美洲主要以ArmA和RmtB为主，欧洲以ArmA为主，拉丁美洲以RmtD为主[25，26]。亚洲地区16S rRNA甲基化酶基因型别与北美相近。RmtA和RmtD分别只在日本和巴西的铜绿假单胞菌发现并报道[7，27]。在中国，Yu等[28，29]发现温州地区分离的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌临床分离株中只能检测出ArmA和RmtB，且阳性率较高，分别为5.4%和6.2%，两种菌的检出率相近。Yu等[30]在分离自我国多家医院的亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌中发现普遍存在ArmA，且位于染色体上，没有发现RmtB。Wu等[31]报道在上海瑞金医院分离的723株大肠埃希菌和202株肺炎克雷伯菌中，ArmA的检出率分别为0.6%和3.0%，而RmtB的检出率为分别为2.8%and 1.0%。Zhou等[32]在上海华山医院分离的氨基糖苷类药物耐药的革兰阴性杆菌中也检出ArmA和RmtB。尽管在日本发现了RmtA、RmtC和NpmA，但是在亚洲其他国家没有发现这些酶。中国分离的革兰阴性杆菌中只检测出ArmA和RmtB，没有发现其他型酶。Yu等[28,29]发现大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌临床分离株中的16S rRNA甲基化酶以RmtB为主，Wu等[31]报道了类似的结果。但是，Yu等[30]在鲍曼不动杆菌中只检测出ArmA；Zhou等[32]在89株鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌临床分离株中发现85株ArmA阳性，只有4株RmtB阳性。由此可见，16S rRNA甲基化酶在中国分离的肠杆菌科细菌中以RmtB为主，在非发酵菌临床分离株中以ArmA为主。虽然在日本发现了较多的16S rRNA甲基化酶型别，16S rRNA甲基化酶基因在日本分离的临床分离株中的检出率还是很低，Yamane等[33]在分离自169家医院的87626株革兰阴性杆菌中仅发现26株菌携带16S rRNA甲基化酶基因。这些研究结果表明，致病革兰阴性杆菌的16S rRNA甲基化酶基因已在全球范围内传播，虽然总的发生率仍偏低。除了在革兰阴性杆菌中发现16S rRNA甲基化酶，最近有报道在革兰阳性球菌也发现了16S rRNA甲基化酶，如金黄色葡萄球菌[34]。

除了在临床分离株中发现产16S rRNA甲基化酶的菌株外，分离自动物的肠杆菌科细菌检测出16S rRNA甲基化酶，并且16S rRNA甲基化酶的检出率非常高[35-38]。2007年我国报道从广州地区的猪肠道内分离的大肠埃希菌和阴沟肠杆菌中检测产RmtB型16S rRNA甲基化酶菌株，阳性率高达32.0%，且RmtB的编码基因全部位于可自我转移的质粒上[38]。大量的氨基糖苷类药物，包括卡那霉素、庆大霉素、安普霉素和链霉素在兽医药中应用，这可能作为一种抗生素选择压力，导致肠道革兰阴性菌获得16S rRNA甲基化酶基因，该基因可能来自环境中非致病性放线菌，它自身就可以产生氨基糖苷类抗生素或类似的16S rRNA基因抑制剂，动物中肠道革兰阴性菌可以保留16S rRNA甲基化酶基因，并可通过人类食物链进行传播。因此，监测畜牧业养殖环境中16S rRNA甲基化酶介导的革兰阴性菌对氨基糖苷类抗生素高水平耐药情况也是同样重要的。

3 16S rRNA甲基化酶导致氨基糖苷类抗生素耐药的临床意义

尽管目前全球范围内产16S rRNA甲基化酶的革兰阴性杆菌的流行率较低，但这仍应引起临床的关注。首先，这些革兰阴性杆菌对临床上最常用的氨基糖苷类抗生素呈高水平耐药，包括庆大霉素、妥布霉素和阿米卡星，且增加剂量也无效；其次，所有已知的16S rRNA甲基化酶的结构基因与可移动的遗传因素有关，如转座子，其中某些已被证明是有功能性的，使其可以水平传播给其他菌株和物种，armA主要通过转座子Tn1540转移，在armA也存在IS26[17，43]。其他类型的质粒介导的16S rRNA甲基化酶基因的转移也与插入序列有关，如rmtA的周围序列存在 IS600，rmtC的周围序列存在 ISEcp1，而rmtD 的周围序列存在 ISCR[16，26，44]。16S rRNA 甲基化酶基因位于这些可移动的元件中极易导致该基因在质粒之间、质粒与染色体之间及染色体之间发生转移，造成耐药基因的快速转移。最后，这些微生物具有很大潜力通过获得各种β-内酰胺酶的基因而成为多重耐药菌株。有研究表明16S rRNA甲基化酶基因可与ESBL基因共同存在于同一菌株中，甚至是同一质粒上[39-42]。Yu等[29]研究发现16S rRNA甲基化酶基因阳性的肺炎克雷伯菌除2株菌外，16S rRNA甲基化酶基因阳性株检测到ESBL基因，主要型别为 blaSHV-12、blaCTX-M-14和 blaCTX-M-15。在韩国也有类似的报道[23]。除ESBL基因外，16S rRNA甲基化酶基因还通常和AmpC基因、碳青霉烯类酶基因及喹诺酮类耐药基因等共同存在同一菌株，导致多重耐药，甚至泛耐药。RmtD最初在巴西被发现存在于产SPM-1金属β-内酰胺酶的铜绿假单胞菌中，这两种基因的共存使其对碳青霉烯类和氨基糖甙类均耐药。Yu等[28]发现存在于大肠埃希菌中的rmtB下游存在喹诺酮类药物的外排泵基因qeqA，qeqA与rmtB共存于同一质粒上导致细菌对氨基糖苷类抗生素和喹诺酮类抗生素同时耐药。

4 16S rRNA甲基化酶介导的氨基糖苷类抗生素耐药的检测

检测16S rRNA甲基化酶介导的氨基糖苷类抗生素耐药可能会对临床实验室构成挑战。革兰阴性杆菌通常可以产氨基糖苷类修饰酶，如乙酰转移酶、核苷转移酶和磷酸转移酶类。当单个微生物产生多于1种氨基糖苷类抗生素修饰酶时，它就可能对多种氨基糖苷类抗生素均耐药。由于16S rRNA甲基化酶对G1405进行甲基化，导致它在体外对除链霉素以外的所有氨基糖苷类抗生素高水平耐药(MIC＞256g/L)。然而，这在临床实验室进行常规药敏试验时很难辨别，特别是使用自动化药敏试验系统只测定接近每种氨基糖苷类药物折点的MIC值。16S rRNA甲基化酶介导的耐药的一个特征性是能导致对阿贝卡星高水平耐药，阿贝卡星是一种衍生于地米卡星的半合成氨基糖苷类，它具有抗金黄色葡萄球菌以及革兰阴性菌的活性，它在日本目前只用于治疗多药耐药的金黄色葡萄球菌感染[45]。然而，阿贝卡星不容易获得的。当某一株肠杆菌科或葡萄糖非发酵菌株对多种氨基糖苷类抗生素耐药时，就可以使用庆大霉素、丁胺卡那霉素和阿米卡星的纸片扩散试验进行检测。如果没有或只观察到较小的抑制环，那么就可怀疑16S rRNA甲基化酶的存在。Yu等[28，29]发现所有产16S rRNA甲基化酶株对庆大霉素、妥布霉素和阿米卡星呈高度耐药，MIC值都≥256mg/L，在MIC值低于256mg/L的菌株中没有检测出16S rRNA甲基化酶。所有耐阿米卡星的菌株同时耐庆大霉素和妥布霉素，阿米卡星预示对庆大霉素和妥布霉素的敏感性。绝大多数的阿米卡星耐药菌株携带质粒介导的16S rRNA甲基化酶基因，且阿米卡星敏感的菌株中没有检测出16S rRNA甲基化酶。因此，阿米卡星是筛选16S rRNA甲基化酶基因的理想药物，当阿贝卡星耐药，特别是当阿米卡星MIC值≥256mg/L或无抑菌圈时，提示该细菌可能产16S rRNA甲基化酶。使用阿贝卡星能够提高该试验的阳性预测值达到90%，相比只用丁胺卡那霉素，阳性预测值只达到约60%[23]。另外，如果使用氨基糖苷类抗生素的MIC值，那么出现256μg/mL的临界值时会提高阳性预测值。目前，PCR是唯一的确证方法。可以使用多重PCR法检测肠杆菌科和不动杆菌属中的armA,rmtB和rmtC，以及铜绿假单胞菌中的rmtA和rmtD。

总之，氨基糖苷类抗生素的耐药问题越来越严重，特别是近年来出现的16S rRNA甲基化酶导致的耐药性更严重，临床实验室应加强对氨基糖苷类抗生素耐药菌株的监测，预防耐药株的播散。

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