同种异体间充质干细胞的成骨诱导联合益骨汤治疗骨缺损的研究

哈尔滨医科大学附属第一医院（150001）宋烜赫 杨卫良

骨缺损引起的相关疾病是严重影响人生活质量和社会劳动力的常见病。长期以来，骨缺损修复都属于重要的研究课题，迄今为止，临床对创伤、感染和肿瘤切除后所造成的大范围骨缺损的修复仍未得到有效的解决。人们尝试过很多治疗方法，但均存在一定的问题和缺陷。如自体骨的移植，其来源有限且对机体产生新的创伤，在临床中很难实现，意义不大；异体骨移植存在免疫排斥反应，影响治疗效果；一般的人工合成替代物植入后常会引起感染、假体松动及异物反应等并发症。有材料表明，间充质干细胞的抗原性较弱[1]，如能以同种异体间充质干细胞与组织工程材料相结合，在体内及体外诱导生成骨组织，将为骨缺损的治疗开辟一个崭新的领域。间充质干细胞是具有多向分化功能的细胞，其在成体细胞中含量极少，但可以通过分离提纯及扩增培养大量获得，并在定向诱导剂的作用下向成骨方向转化。本实验鉴于上述情况开展了间充质干细胞进行成骨诱导并治疗骨缺损研究，希望能找到新的更合适的骨源，并在其基础上进行自拟中药复方益骨汤对骨缺损辅助治疗作用的探讨。

1 材料和方法

1.1 MSCs的分离培养 选取雄性大白兔，体重为2.5kg±500g。用含肝素30u/ml的注射器于股骨粗隆抽取骨髓2ml加入含10%胎牛血清和青霉素及链霉素的DMEM培养基（Gibsco公司）中，吹打混匀，置培养瓶中，37℃、5%C02、95%相对湿度的孵育箱内培养。5d后半量换液，1周后全部换液，以后每周换液2次，逐步去除未贴壁细胞。14d后贴壁细胞汇合到90%生长面积时，用0.25%的胰蛋白酶消化，按1∶2传代，取第2代MSCs备用。

1.2 MSCs纤维蛋白复合物的制备 取第2代细胞计数后制成5.0×106/ml的细胞悬液，按1∶1与纤维蛋白（医用安可胶）混合，置12孔培养板、37℃孵育箱内聚合1h，收缩过夜后备用。用条件培养液培养诱导3天，诱导MSCs向成骨细胞分化。

1.3 骨缺损模型的制作及处理 选用4～5个月龄清洁级雄性日本大耳兔20只（哈尔滨医科大学动物中心提供），重2.5kg±500g。3%戊巴比妥30 mg/kg耳缘静脉麻醉，取膝关节外侧切口显露股骨髁, 用手钻在股骨髁外侧宽大处制作0.6cm×1.0cm的松质骨缺损。冲洗干净骨屑后，将同种异体MSCs复合物植入大白兔股骨缺损处。实验组用益骨汤灌胃，按照人/兔体表面积换算服药量，1次/d，对照组采用相同方法以蒸馏水替代中药汤剂。术后不固定肢体，分笼饲养，连续3 d使用青霉素预防感染。

1.4 术后观察 观察动物的进食、活动和切口愈合情况。分别于术后8、12、16、24周进行骨密度测定及镜下组织观察，以了解骨缺损的修复。各期用空气栓塞法处死动物5只，大体观察缺损区修复情况，切取股骨标本，用10%中性福尔马林溶液固定，脱钙切片后HE染色，光镜下观察新生骨痂和骨缺损愈合情况。

2 结果

2.1 骨髓间充质干细胞体外培养及诱导情况 骨髓用淋巴细胞分离液分离出的细胞为较单一的圆球形细胞，倒置显微镜下观察，见原代细胞培养24小时后大部分细胞贴壁生长，细胞逐渐从圆球形变成短梭形、长梭形，形态饱满。72小时后贴壁细胞分裂增殖明显，并逐渐形成细胞团、集落。以后集落不断增大，相互汇合，约12d后细胞铺满培养瓶底。有些不贴壁的细胞，呈圆形，大部分随换液除去。传代约4小时后细胞开始贴壁，贴壁细胞呈梭形、多角形，传代后细胞形态无明显变化，但增殖速度加快。

2.2 ALP测定结果 细胞经条件培养液诱导培养后，ALP活性明显增高，3天后实验组即明显高于对照组，随后实验组逐渐升高，8天左右达到高峰，其后稍有下降，但仍高于对照组。ALP测定结果提示经诱导培养的细胞具有较强碱性磷酸酶活性。2.3 放射学检查 实验组：术后第8周骨缺损区两断端有少量骨痂形成；术后第12周骨缺损区两断端有大量模糊骨痂形成；术后第16周骨缺损区新骨密度增高，部分骨皮质连续；术后第24周骨缺损区新骨塑形好，骨皮质连续，新骨髓腔较通畅。对照组：术后第8周骨缺损区无明显变化；术后第12周缺损区骨两断端出现少量骨痂阴影；术后第16周缺损区有模糊骨痂生长，骨痂向移植物长入；术后第24周缺损区骨痂生长逐渐增多，两断端连接不完全，新骨再生塑形差，髓腔未再通。

3 讨论

MSCs是一种可以分化为多种中胚层细胞的成体干细胞，有证据表明MSCs具有体外成钙、体内成骨的能力。近年基于此的组织工程取得了诸多进展，主要表现在以自体骨髓MSCs为种子细胞复合不同载体修复各类骨缺损的实验研究和初步的临床应用。但自体MSCs的回植须经历抽取骨髓、培养扩增及质量控制检测等阶段[2]，并且自体骨髓MSCs的增殖、成骨分化能力随着年龄的增加而减弱[3]，不适合临床应用。

Arinzen等[2]使用同种异体MSCs复合羟基磷灰石-磷酸三钙成功修复了狗股骨的节段性骨缺损，并指出其修复效果与自体MSCs相似，明显优于无细胞植入组。骨缺损的研究多采用皮质骨节段性骨缺损为模型，但也有研究员指出兔股骨髁0.6 cm×1.2 cm的松质骨缺损不能自行愈合[4]。本实验也支持这种观点，兔股骨髁的松质骨缺损模型是可行的。

国内外的许多学者也尝试了中药在骨折愈合中的作用并进行了大量的研究[5～8]。周重建[9]发现，使用益气化癖中药能促进骨折断端及其周围毛细血管的开放量，而且多核巨噬细胞活性明显增强。林燕萍也报道[10]，服用煅狗骨后骨折处的血肿吸收和机化明显快于对照组，认为煅狗骨具有活血通络、健脾生肌的效应。另有学者[11][12]发现，肢伤三方（续断、当归、白芍、土鳖等）具有刺激大白兔骨折局部新生毛细血管网的形成，改善骨折局部的血液循环，加快新陈代谢，强有力地刺激成骨细胞的活性。同时在骨折愈合处I型胶原表达增强。林润台[13]通过对骨折愈合过程中超微结构的研究发现，用丹参后成纤维细胞核仁有着边、核凹陷的现象，特别是形成胶原的粗面内质网容量增加。由此推测成纤维细胞蛋白质合成旺盛，有利于产生更多的胶原纤维，促进骨折愈合。

本实验应用益骨汤，其药物组成为骨碎补、丹参、川牛膝、枸杞子、山药、炒山楂、薄荷和陈皮。其中，骨碎补，味苦，性温，入肝、肾经，功用补肾强骨，活血止血，续伤止痛，不但可治疗肾阳不足之骨萎肉却而治本，亦可活血通络而治病之标。川牛膝，味苦、酸，性平，归肝、肾经，功用活血通经、引血下行、补肝肾、强筋骨、利水通淋。川牛膝之于治疗骨蚀，亦属于既能补遗强壮、又能活血通利的标本同治之品。枸杞子，味甘质润而性平，功用滋补肝肾、益精养血，长于治疗肾精肝血不足所致髓枯骨残。骨碎补和枸杞子，一疗肾之元阳不足而冷痹骨萎，一疗肾之阴精不充而髓枯骨萎，二者相互配合，共同切中肾虚骨萎的核心病机。丹参，味苦而性微寒，可活血通痹。《别录》称其主“腰脊强、脚痹”，亦以清通气血之功，而能除血瘀血热、宣络蠲痹，治疗骨节疼痛、四肢不遂，亦可助诸般补益肝肾之品达于病所，而收治疗骨萎之功。山药，味甘，性平，归脾、肺、肾经，功用益气养阴、补脾肺肾。其具备的补中益气而温养肌肉与益肾固精而疗肾虚腰痛的双重功效，使其成为治疗骨萎之证所必须。陈皮，味苦辛而性温，归脾、肺经，可理气健脾、祛湿消痰。盖脾气健运，气机调畅，经络痰湿得消，则可助精微消化、吸收、布散以调治骨萎。炒山揸，味酸、甘，性微温，归脾、胃、肝经，功效消食化积、行气散瘀，亦可助精微消化、吸收、布散以调治骨萎。薄荷，味辛，性凉，归肺、肝经，其力能内透筋骨、外达肌表、宣通脏腑、贯串经络。故对于肝失调达、肝气郁结所致之气血阻滞、骨髓脉络失养之病机，以薄荷最宜。

在中药对于细胞及生长因子的调节机制研究中，林燕萍[10][14][15]等发现，煅狗骨促进垂体TSH细胞功能的同时也促进OH细胞功能，促进甲状腺素的分泌，并认为锻狗骨可能通过甲状腺激素和生长激素的直接或间接作用，刺激骨折断端的成骨细胞和破骨细胞的活性，促进新生骨小梁的形成，最终促进骨折的愈合。刘献祥[15]用免疫组化技术进行图像定量分析的结果表明，中药（补肾复方）能明显提高骨折模型家兔骨折处骨痴DNA指数和BMP含量，促进和诱导BMP的合成，加速骨折愈合。

本实验相同时期实验组与对照组相比有明显改变：①中药治疗组明显促进和缩短骨缺损修复时间；②使用中药治疗后血肿吸收和机化时间明显缩短；③服用中药期间，间充质细胞呈梭形改变明显，骨核细胞浓缩，染色质凝聚靠边，有大量的胶原纤维，细胞质容量的增加，特别是形成胶原纤维的粗面内质网容量增加。结果表明，同种异体间充质干细胞的成骨诱导辅以中药益骨汤治疗骨缺损，不但能有效缩短病程，提高患者生活质量，减轻患者痛苦，而且中医的辨证论治方法可以实现真正的个体化治疗，即针对不同人群的不同体质骨破损后产生的不同症状遣方用药，避免了重复用药的弊端。此外，中药制剂方便易寻，价格低廉，便于推广应用。