CREB参与慢性应用吗啡引起的神经元和突触的可塑性和适应性

李华 王丽

反复应用阿片类药物，机体启动适应机制，神经元及突触功能产生适应性改变，导致神经元及神经网络功能发生长期改变，是机体形成药物依赖和耐受的机制之一［1］。目前研究认为，阿片和其他成瘾药物具有共同的细胞和解剖通路，而受体后细胞、突触和神经网络的适应性改变是成瘾形成的关键［1］。阿片类药物与其受体结合后，通过升高胞浆内环磷酸腺普(cAMP)水平［2－4］和游离 Ca2+浓度(intracellular free Ca2+concentration，［Ca2+］i)［5－7］，分别激活 cAMP 依赖蛋白激酶 A(cAMP-dependent protein kinase A，PKA)［2－4］及钙调蛋白依赖蛋白激酶(calmodulin-dependent kinase，CaMK)［8－10］，使转录因子cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element-binding protein，CREB)的Ser-133磷酸化而激活CREB，从而持续调节其下游基因表达，参与神经元与突触的可塑性与适应性［2－4，8－10］。本文就 CREB 与阿片类物质依赖与耐受形成的关系作一综述。

1 CREB及其活性调节

1.1 CREB 作为多基因家族的一员，转录因子CREB主要通过cAMP反应元件(cAMP response element，CRE)介导cAMP和Ca2+依赖的基因表达。CRE由TGACGTCA序列组成，主要位于许多基因启动子内TATA盒上游100个核苷酸处［8］。CREB是由结构相关的蛋白组成的一个大家族CREB/ATF(activating transcription factor，ATF)中的一员，该家族与基因起动子内的CRE结合。至少10种基因产物属于CREB家族的一部分。通过不同的剪接，多数基因产生几种异构体，从而使因子数目增大。例如，CREB基因产生3种主要的因子(α、β和δ)。除了转录激活因子，CREB家族还包括转录抑制因子。例如，cAMP反应元件调节因子(cAMP response element modulator，CREM)至少包括4种不同的抑制因子，分别为CREMα，β，γ和可诱导的cAMP早期抑制因子(inducible cAMP early repressor，ICER)，可阻断CRE依赖的基因转录［8］。

1.2 CREB的活性调节 酶复杂的级联反应调控CREB的活性。细胞外刺激通过升高细胞内cAMP或游离Ca2+，在数分或数秒钟后，CREB便被激活。随着胞外刺激引起胞浆内cAMP水平升高，PKA的催化和调节亚单位迅速分离，催化亚单位被动移位至细胞核，并在细胞受到刺激后15～20 min达到高峰。PKA导致CREB内的PKA磷酸化位点(RRPSY)中Ser-133磷酸化。Ser-133磷酸化被认为是介导转录起始的关键事件，因为Ser-133突变为丙氨酸将取消转录［8，11］。细胞内Ca2+水平升高通过Ca2+/钙调蛋白依赖蛋白激酶Ⅳ(Ca2+/calmodulin-dependent kinaseⅣ，Ca2+/CaMKⅣ)使 Ser-133磷酸化而激活CREB。Ca2+激活CREB可能通过钙调蛋白从胞浆移位到胞核。Ca2+调节的其他CREB激酶包括 p70 S6激酶(p70 S6 kinase，p70S6K)、p90 核糖体 S6 激酶(p90 ribosomal S6 kinase，p90RSK)家族成员和PKA。在体外，这些酶均可磷酸化CREB。在激活CREB时，这些激酶均位于细胞核内。CREB的磷酸化状态也受磷酸酶调节。在海马神经元，Ca2+/CaM通过激活calcineurin激活一种核磷酸酶，即蛋白磷酸酶-1(protein phosphatase-1，PP-1)，进而导致磷酸化 CREB(phosphorylated CREB，pCREB)去磷酸化［8－10］。在纹状体，由多巴胺D1/D5受体诱导的pCREB的持续时间通过激活PP-1的抑制剂，即多巴胺和3＇，5＇-腺苷酸调节的磷蛋白(dopamine and adenosine 3＇，5＇-monophosphate-regulated phosphoprotein，DARPP-32)而得以延长［8］。

另外，CREB活性通过转录抑制因子而被抑制。例如，CREM α、β和γ，由于缺乏Q区域而不能与转录系统互相作用，从而通过CRE对cAMP依赖的基因转录起负调控作用。CREM类抑制因子可通过与CREB激活因子竞争与CRE的结合或通过与CREB激活因子结合形成无功能异二聚体，来发挥抑制作用。值得注意的是，CREB通过调控ICER抑制因子的激活，从而对其所调控基因的表达活性进行负反馈调节［8］。

1.3 CREB启动基因转录的过程 CREB家族成员均包含亮氨酸拉链结构。这些蛋白通过并列的碱性氨基酸残基发生二聚体化，形成识别特定寡核苷酸序列的DNA结合域。当CREB经磷酸化激活形成pCREB时，pCREB便于特定的DNA序列CRE结合，从而启动基因转录［8］。pCREB还可解除CREM类抑制因子的抑制作用［8］。

当CREB的Ser-133发生磷酸化形成pCREB时，pCREB便与一种转录共同激活蛋白，即CREB结合蛋白(CREB binding protein，CBP)或其同源类似物p300结合。CBP和p300均为包含多种蛋白与蛋白相互作用区域的大分子。在体外，CBP与转录因子TFⅡB相互作用，而CBP可能是RNA聚合酶Ⅱ全酶复合物的成分之一。另外，CBP是一种组蛋白乙酰转移酶(histone acetyl transferase，HAT)，并与 p300/CBP相关蛋白 P/CAF(p300/CBP-associated protein，P/CAF)结合，该蛋白也有 HAT活性。HAT催化组蛋白氨基末端的赖氨酸残基发生乙酰化。乙酰化作用能中和介导DNA-组蛋白相互作用产生的电荷。CREB-CBP-P/CAF复合物诱导乙酰化作用，使组蛋白-DNA的相互作用松弛，导致即刻早期基因(immediate early gene，IEG)启动子上的转录起始复合物易于装配。CREB与CBP的相互作用及随后募集RNA聚合酶Ⅱ，对cAMP依赖的基因转录来说，尚不充分。启动基因转录，仍需要其它成分，如TFⅡD［8］。

除了CRE需要CBP，其它的信号转导通路也需要CBP。这些通路激活佛波醇酯元件(phorbol ester element，TRE)和血清反应元件(serum responsive element，SRE)，显示CBP作为转录辅助激活因子，具有多种功能。

2 阿片依赖引起CREB经磷酸化激活

2.1 阿片依赖引起神经元内cAMP升高 在慢性吗啡依赖的动物试验中，均可发现中枢神经系统内cAMP水平明显升高，与离体培养的原代神经元和细胞株在受阿片类长时程作用的结果一致［11］。已知阿片受体均为具有7个跨膜片断的G蛋白藕联受体。这些G蛋白均为抑制型G蛋白(Gi和G0)［12－13］。慢性应用阿片类，配体与其结合后，抑制腺苷酸环化酶(adenylyl cyclase，AC)的活性［12］。所以慢性应用吗啡后细胞内cAMP升高不是阿片类直接作用的结果，可能与细胞内Ca2+内流增加，从而选择性上调对Ca2+敏感的Ⅷ型和Ⅰ型AC有关［12，13］。cAMP调节细胞众多的功能，如细胞代谢、分泌、增生、分化、凋亡及诱导基因表达。在哺乳动物细胞中，cAMP通过PKA发挥作用。

2.2 阿片依赖引起神经元内游离浓度(［Ca2+］i)升高 细胞内游离Ca2+作为第二信使参与细胞功能的调节，在神经元的信号转导中起重要作用。慢性应用吗啡，可导致［Ca2+］i升高［5－7，10］。Ca2+进入突触后神经元的胞浆，主要有四条通路:通过N-甲基-D-天冬氨酸型(N-methyl-D-aspartate-type)和α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionate-type型谷氨酸受体;通过电压门控Ca2+通道;通过细胞内钙库释放。

在电压门控性钙通道中，根据电导值、动力学特性等的不同，又分为几种亚型，现知有L、T、N和P型。L型(long-lasting)开放时间久，约10～20 ms，表现为持续长时钙内流，电导值25 pS，激活电位－10 mV，失活电位 －60～－10 mV，衰变时间＞500 ms。T型(transient)的开放时间短暂，引起瞬间短小Ca2+电流，电导值9 pS，激活电位 －70 mV，失活电位－100～－60 mV，衰变时间20～50 ms。N型(neither L nor T)见于神经元中，调节神经递质释放，电导值13 pS，激活电位－10 mV，失活电位－100～－40 mV，衰变时间50～80 ms。P型最初在哺乳动物小脑浦肯野细胞中发现，故名，电导值随条件不同变动为9 ～19 pS，激活电位 －50 mV，失活极慢，t1/2约1 s。

通过激活质膜的电压或配体门控钙通道，导致细胞浆和细胞核内Ca2+水平升高，激活CaMK。在体外，CaMKⅠ、Ⅱ和Ⅳ均能单独使CREB的Ser-133发生磷酸化，CaMKⅣ则被认为在细胞内起主要作用。CaMKⅣ位于细胞核内［8，10］，其激活的动力学在时间上与CREB的Ser-133磷酸化和去磷酸化相关［9，10］。采用CaMKⅣ反义寡核苷酸或同源物遗传重组，使CaMKⅣ失活，而降低激酶活性依赖的CREB的Ser-133磷酸化，表明CaMKⅣ是内源性膜去极化激活CREB的激酶活性的重要部分。Ca2+内流也引起Ras/MAPK信号通路激活，在激活核Rsk激酶时，Ca2+内流达到高峰。在生长因子引起的信号转导中，Rsk2被认为是第一个使CREB的Ser-133发生磷酸化的激酶。Rsk激酶也通过膜去极化激活，提示其可介导生长因子及Ca2+依赖的CREB磷酸化。对许多不同刺激，Ras/MAPK/Rsk和CaMK信号途径的激活相同，提示这两条通路在CREB的激活中可能起协同作用。根据CREB赖磷酸化的动力学分析显示，在膜去极化后，CaMKs似乎控制CREB磷酸化的快速时相，而Ras/MAPK信号转导途径激活较慢，便成为以后时间内主要的 CREB 激酶［8］。

3 CREB与神经元和突触的适应性

3.1 阿片依赖与与神经元和突触的适应性 阿片类引起机体稳态重建，使中枢神经系统功能发生紊乱，从而产生阿片依赖。其中神经元与突触相应的适应性被认为起重要作用［1］。在大脑某一结构中，神经元的可塑性与适应性表现为改变转录活性的刺激随后可改变这一区域内信息处理方式;在整体水平，可塑性与适应性导致个体与其周围环境的相互作用发生改变，如学习、感知、理解及对环境刺激的行为反应发生改变［4］。

阿片药物成瘾的主要特征为耐受、戒断综合征及强迫用药，而对其形成的生物学基础尚未阐明［1］。目前认为，反复应用阿片类药物，机体启动适应机制，导致对阿片敏感的神经元及神经网络的功能发生短期及长期改变。适应机制之一是耐受的形成，即为了获得理想效果而需要愈来愈高的剂量。相关或条件耐受指应用吗啡时，总是伴随特定的环境，该环境在耐受形成中起重要作用，并在动物行为中由特定的神经系统所介导。非相关或细胞耐受过程却受到广泛关注。在中枢神经系统、分离组织和细胞中，有2种常见的非相关耐受，一种发生在阿片受体水平，此时效应器藕联减少;另一种发生在细胞、突触和神经网络水平，由于发生了反适应改变，尽管有持续的药物活性，仍保持正常功能。反适应形成的另一结果是一旦停止用药，将显现一系列反跳症状和体征。这一戒断综合征具有持续短期、长期和很长时间的特征，包括在急性戒断症状停止后的很长时间内，对药物的渴望和复吸［1］。慢性应用阿片类的结果，中枢神经系统内形成的最重要的适应，是从偶然用药过渡到强迫用药。耐受和戒断确实参与了这一过程。慢性应用阿片类药物造成的这些长期适应表现在无诱发药物存在的情况下，提示特定的中枢神经系统功能发生了长期改变［1，13，14］。值得注意的是，神经元和突触适应过程形成的机制使人联想到正常的突触可塑性形成机制［1，15］。突触可塑性(synaptic plasticity)指突触功能强度的改变，这一过程通常是神经生物学领域关于学习和记忆研究的主要焦点。突触可塑性包括神经传递强度或效力的短期改变以及突触结构和数目的长期改变，如被认为是形成记忆的细胞基础的突触传递的长时程增强(longterm potentiation，LTP)及长时程减弱 (long-term depression，LTD)。分布在神经元连接中的成千上万的突触强度的正向和负向调节，被认为是形成学习和记忆的物理和生化基础。在低等动物中，包括蜗牛、果蝇和啮齿类动物，对这些过程的细节已知晓很多。事实上，人脑和动物脑的区别是神经元连接的数目和复杂程度，而不是基本的化学过程［16］。

导致阿片依赖的自发用药和适应的生理机制代表病理记忆的类型。在细胞和突触水平，LTP和LTD在滥用药物诱导的突触的适应与其它的活性依赖的可塑性中，其形成机制相同［1］。活性依赖的可塑性来自吗啡对单个细胞的兴奋性或递质释放的直接效应。阿片的间接效应也同样重要，例如，尽管海马的锥体细胞不受阿片类的直接影响，但由于阿片对GABA中间神经元的抑制而介导的抑制解除增加锥体细胞的兴奋性，从而使一些形式的LTP易于形成。研究表明，在人类中枢神经系统，突触可塑性的分子机制与自发用药直接相关［1］。

3.2 CREB参与神经元和突触的适应性 2000年诺贝尔奖获得者Eric Kandel描述记忆过程为基因与突触间的对话［16］。短时程记忆与突触功能的暂时改变相关，该过程需要酶的激活及蛋白磷酸化，而无需新蛋白合成。长时程记忆则需要转录因子，如CREB等激活，启动基因转录及合成新的蛋白质，从而增强活化突触的传递强度或数目，而参与突触的可塑性过程。这一参与长时程记忆的分子机制在蜗牛、果蝇、啮齿类和人类之间的过程相同。而CREB本身也被认为是参与长时程记忆的记忆分子［1，8，16］。

寻找与成瘾有关的极其稳定的分子适应机制所遇到的困难，与学习和记忆领域面对的挑战相同［1，14］。尽管有成熟的学习和记忆的细胞和分子模型，但仍未确定足够长期的细胞和分子适应机制以解释高度稳定的行为记忆。可能的机制之一是通过CREB介导很短暂的基因表达改变，而介导神经元形态学和突触结构的长期改变。例如，在海马锥体神经元，增加树突突起的密度及LTP时谷氨酸能突触的效力。另一种可能是转录因子CREB的短暂激活通过修饰染色质，导致基因表达更持久的改变。CREB和许多其它的转录因子被认为通过促进靶基因周围的组蛋白发生乙酰化或去乙酰化而激活或抑制靶基因转录。尽管组蛋白乙酰化或去乙酰化发生非常快，但是CREB在控制组蛋白乙酰化的酶系统方面产生更持久的适应。CREB也可能通过调节DNA或组蛋白的甲基化，使基因表达发生更持久的改变［14］。

综上所述，在阿片类依赖和耐受形成中，CREB通过介导cAMP和Ca2+信号转导而诱导靶基因表达，参与神经元和突触的适应性过程。由于CREB与CRE组成的复合物是多效性的激活剂，参与许多细胞及病毒的基因转录，而目前不清楚何种基因产物从核内移位到特定的突触，并通过何种机制参与神经元与突触的适应性过程［8］。也许从基因组范围进一步分析，将更有益于理解当CREB发生改变时所导致的分子改变与滥用药物所导致的行为反应之间的相关关系［3］。

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