酶的固载技术及纳米电化学酶生物传感器的研究进展

李文娟，袁 若，柴雅琴

（西南大学化学化工学院，重庆400715）

0 引言

生物传感器是在化学传感器的基础上发展起来的，是电化学分析和生物技术研究最为活跃的领域之一。其中，纳米电化学酶生物传感器因其具有灵敏度高、准确度高、选择性好、检测限低、价格低廉、稳定性好、能在复杂的体系中进行快速、在线连续监测等优点，在生物传感器领域研究中占有重要的地位[1]。

在酶生物传感器的研制过程中，酶的固定化方法是一项关键性的步骤。所选用的固定技术和固载材料的性质将直接影响固定化酶的性能，进而影响到传感器的灵敏度、稳定性和选择性等一系列性能指标。该文旨在介绍近几年来酶生物传感器的固定化方法和固载材料的研究现状，并展望其发展前景。

1 酶的固定化方法

酶蛋白在固定化的进程中，容易引起酶本身性质的改变，从而影响其催化活性和生物性能。究其原因一般有两种可能：一种是酶本身性质的变化，主要是酶活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化；另一种是受固定化载体的物理或化学性质的影响，主要体现在固定化酶的周围，形成了能对底物产生影响的扩散层，以及静电的相互作用等引起的。所以，要研制出价格低廉、灵敏度高、选择性好和寿命长的酶电极，选择合适的固酶方法和载体材料是至关重要的。目前，较成熟的酶的固定化方法一般有：吸附法、交联法、共价键合法以及包埋法等。下面，具体来介绍一下每种固定方法。

1.1 吸附法

是将酶、氧化还原蛋白质经非水溶性载体物理吸附或离子结合作用使生物组分固定的方法。这些结合力可能是氢键、范德华力或离子键等，也可能是多种键合形式共同发挥作用。该固定方法操作简单、无需化学试剂、活化和清洗步骤少、对生物活性影响小、酶可以保持较高的生物活性等优点；同时还具有工艺简便及条件温和，其载体选择范围很大，酶失活后可重新活化，载体可以再生[2]。缺点是酶在电极表面吸附的牢固程度与溶液的pH、离子强度、温度、溶剂性质和种类以及酶的浓度有关。当酶与载体之间吸附作用较弱时，酶易从载体上脱落，影响传感器的稳定性和寿命。同时酶与载体之间的吸附是可逆过程，随着时间的流逝，解吸附作用会降低传感器的灵敏度。现如今，各种各样的固载材料被用于对酶蛋白分子的吸附，比如碳纳米管、水滑石、羟基石灰石、粘土、高岭土等载体，例如：Rahman等[3]报道了通过吸附作用，将葡萄糖氧化酶（GOD）其捕获到多壁碳纳米管 （MWCNT）修饰的金电极表面，实现了GOD蛋白分子的直接电子传递。并且在较低的电位条件下，对葡萄糖显示出良好的电催化作用。Dmitri Ivnitsk等[4]考察了将胆红素氧化酶（BOD）吸附固定在碳纳米管（CNT）表面的电化学行为。经研究，BOD在碳纳米管表面的直接电子转移速率常数可达1.5 s-1。

1.2 包埋法

是将生物蛋白分子包裹在溶胶-凝胶、聚合物材料以及高分子载体分子中形成三维的空间网状结构，以实现对生物分子的固载。在这个过程中，蛋白分子只是被包埋，并不参与化学反应。所以固定条件较温和、生物活性保留较高及聚合膜的孔径和几何形状可以调控，并且可以固定较高浓度的生物大分子，如酶、抗体等。但是，这种方法将酶包裹在载体内部，使得底物在网络中的扩散阻力增加，电极的响应时间延长，不利于电极的在线检测和微型化。目前，最常用包埋酶的载体是溶胶-凝胶法，因其具有优良的生物兼容性、热稳定性、化学惰性以及在水中几乎不溶胀等性质，从而吸引了科研界和工业界的广泛兴趣。例如：Yuan Ruo课题组[5]采用溶胶-凝胶法将葡萄糖氧化酶（GOD）包埋在二维的网状硅凝胶（MPS）中，由于硅凝胶具有较好的生物相容性，固定后酶的活性高。PengYong等[6]提出了包埋HRP的一种传感器。首先将二茂铁硫醇（FcC11SH）和巯基丙酸（MPA）混合，一起自组装在金电极表面。然后在EDC/NHS化学的作用下，将HRP交联在MPA的残基上，最后，通过聚合丙烯酰胺单体来包埋HRP分子。该传感器对过氧化氢有很好的催化作用，并且能够实现对过氧化氢的超低量检测，可达 0.62 nmol·L-1。

1.3 共价键合法

是酶蛋白分子上的官能团和固相支持物表面上的反应基团之间形成化学共价键连接，从而使酶固定的方法。到目前为止，通常有两类情况：一是将基底电极表面活化，再将酶等生物活性分子直接反应连接到电极表面；二是将载体有关基团活化，然后与酶共价反应。根据酶与载体之间的共价结合形式可以有重氮法、肽键法、烷化法等。使用共价键合法通常需要使用含有双功能基团或多功能基团的试剂，如巯基乙胺、半胱胺酸和戊二醛等，将酶蛋白和电极固载基质之间形成共价键连接，此时该方法也称交联法。例如：Polsky Ronen等[7]将羧基化的叠氮化合物在EDC/NHS的作用下和抗体分子进行偶联，然后将复合物电沉积在电极表面，并通过不同的方法标记的抗原进行反应，制备了免疫传感器。Solanki等[8]首先将碳纳米管、硅溶胶和壳聚糖的混合物滴涂在铟锡氧化玻璃电极表面，在戊二醛的交联作用下，借助醛基和酶氨基的作用下，实现对胆固醇氧化酶和胆固醇酯酶的成功固载。所研制的传感器对胆固醇的相应时间小于10 s，灵敏度达3.8 A·L·mmol-1，米氏常数为 0.052 mmol·L-1，可在冰箱中存放10周之久。Li Jinghong等[9]利用聚赖氨酸使碳纳米管功能化，然后在EDC活化偶联试剂的作用下，将HRP成功固载在电极表面，用于检测过氧化氢。Marrakchi等[10]采用了先将牛血清白蛋白（BSA）和葡萄糖氧化酶（GOD）混合，然后在戊二醛蒸气的氛围中静置一段时间，在戊二醛的作用下，交联和BSA混合的乳糖氧化酶（β-Gal），成功的制备了 GOD-β-Gal的双酶型生物传感器。该传感器可以实现对牛奶中乳糖的定量测定。

由于酶与载体间连接牢固，不易发生酶脱落，有良好的稳定性及重复使用性。但是，共价键合和交联过程可能引起免疫分子高级结构变化，破坏部分活性位点，所发生的剧烈化学反应对酶的存活十分不利。

1.4 层层自组装法

是一种较年轻的固定方法，通过自发的化学吸附（通常是静电作用）或键合作用，在传感器界面形成二维有序单层膜。若自组装分子具有两个或者以上的活性基团，则又可与别的物质反应，如此反复，构筑同质或异质多层膜。由于自组装分子层的有序性、稳定性、绝缘性和可调控性，使通过这种方法所构建的传感器在生物技术领域中大放异彩。目前，发展起来的层层自组装（LBL）技术主要有以下几种类型：

1.4.1 通过正负电荷间静电作用

利用静电作用对带电荷的生物大分子，以静电相互作用力作为推动力进行分子间的交替沉积。 制备多层膜的方法。例如：Liu Baohong课题组[11]将带正电荷的壳聚糖（chitosan）和带负电荷的透明质酸（HA）交替吸附到聚对苯二甲酸乙二酯（PEI）修饰的芯片表面，利用可控有序的多层膜对胰岛素（trypsin）成功的固载。Chen Hongyuan课题组[12]先将普鲁士蓝（PB）用聚阳离子邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯（PDDA）进行反应，形成PDDA保护的PB复合物 （P-PB），然后利用LBL的方法，和表面带负电荷葡萄糖氧化酶（GOD）层层交替吸附在聚苯乙烯磺酸钠（PSS）和PDDA的双层膜上，所研制的传感器拥有良好的稳定性和重复性。

1.4.2 通过化学键合作用

利用生物分子中所含的-SH、-NH2、-COOH、-OH等活性官能团通过相应的化学反应连接在电极表面，来进行对生物大分子多层自组装膜的方法。例如：Kim Hak-Sung等[13]利用席夫碱反应构筑了层层组装的葡萄糖生物传感器。首先，将胱胺二盐酸盐（cystamine dihydrochloride）自组装到金电极表面，然后，将高碘酸盐（IO4-）氧化表面带有醛基官能团的GOD接枝到半胱氨酸的氨基上，再接着在氰基硼酸钠（NaBH3CN）的催化作用下，利用GOD表面未反应的醛基端基与树枝状的氨基二茂铁（Fc-D）高分子聚合物发生席夫碱反应，结合在电极表面。交替反复地重复以上步骤，使Fc-D和GOD层层组装，得到多层酶膜。该方法结合的酶牢固，不易脱落，具有潜在的应用价值。

1.4.3 借助纳米粒子的作用

利用纳米粒子和酶蛋白之间或纳米离子与媒介体直接的结合作用，来实现对生物分子的固载。例如Xu Jingjuan等[14]将金纳米粒子引入层层组装复合膜，构建葡萄糖生物传感器。在多层膜中，金纳米粒子连接于GOD与电极之间，起到了电子导线的作用，并大大加快了电子在膜内的传递速率。Yuan Ruo课题组[15]报道了在多壁碳纳米管上层层自组装血红蛋白和纳米金，实现了多层酶膜的固载。该课题组[16]还构建了将纳米金和电子媒介体甲苯胺蓝进行交替组装，然后固载辣根过氧化物酶，对过氧化氢定量检测。这种方法构建的传感器具有负载酶量多，灵敏度高，稳定性好等优点。

1.4.4 生物蛋白间的特异性识别

利用某些生物大分子和特定的生物分子之间的特异识别进行生物大分子的LBL自组装的方法。目前，属于生物分子之间特异性识别的类型有：酶-底物、抗原-抗体、适配体-凝血酶、抗生素蛋白(亲和素)-生物素、伴刀豆凝集素(Con A)-糖蛋白等。能够用在LBL技术上的主要有抗生素蛋白(亲和素)-生物素和伴刀豆凝集素(Con A)-糖蛋白两种。例如：Lin Xianfu实验组[17]制备运用Con A和天然HRP的相互识别作用，在聚电解质修饰的金电极表面进行交替沉积，形成了HRP的多层薄膜。一个Con A分子可结合四个HRP分子，通过抑制性酶的作用，用于检测硫醇。该生物传感器具有良好的选择性和稳定性。Anzai Junichi等[18]进一步通过Con A和糖蛋白的识别作用，研制出HRP/GOD的双酶型生物传感器，拓展了这种固定方法的应用。Dai Zhifei等[19]利用LBL技术，结合抗生素蛋白(亲和素)-生物素的作用构建了多层复合膜。

上述固定方法各有自己的优缺点，实验发现，单独使用很难达到较理想的效果。所以近年来，研究者经常将两种或两种以上的方法结合使用固定酶。例如：Willner Itamar研究小组[20]结合了吸附和交联的方法制备了葡萄糖生物传感器。首先将PEI功能化的单壁碳纳米管 （SWCNT）沉积在玻碳电极表面，在EDC的作用下，利用PEI分子中的氨基和二茂铁甲酸中的羧基发生酰胺反应，将电子媒介体固定在电极上，然后吸附GOD，最后再用戊二醛交联固定酶。这个试验体系增大了电极的比表面积，促进了酶与电极间的电子传输，并且，传感器性能稳定，10 d后，未发现明显的相应电流衰减。

1.5 较新的固定方法

另外，要保持酶传感器的长足发展，寻求一种既能有效防止酶的泄漏又能长时间保持酶的活性的固载方法是传感器领域不断追求的目标。要能在这些方面有新的突破，开发新的固定方法势在必然。科研工作者不断提出了新的方法：

1.5.1 一锅法（One-Pot）

Xie Qingji研究小组[21]提出了“一锅法”（One-Pot）的固酶策略。首先将1,4-苯二硫醇（BDT）和GOD分散混合在一起，然后慢慢向混合溶液中加入K3Fe(CN)6，进行化学预氧化，产生许多不溶性的BDT低聚体包裹的高活性GOD蛋白分子。最后，将形成的复合物｛BDTO-GOx-K3Fe(CN)6｝通过BDTO的作用聚合在金电极表面，得到了葡萄糖生物传感器。这种方法固定的酶拥有高的生物活性和高的负载量。与传统的电聚合方法相比，灵敏度提高了32倍。在前一个研究工作的基础上，继续扩展了“一锅法”的应用。采用了一锅预合成电聚合的固酶方法，并将纳米粒子引入这一构想中[22]。首先，将多巴胺（DA）和GOD溶液混合均匀后，慢慢向其加入 H2PtCl6溶液，产生了铂纳米离子 （Pt NPs）和DA的低聚体（PDA）。在这里，DA扮演还原剂和单体的角色；H2PtCl6作为氧化剂无触发DA的聚合。然后依靠DA单体的作用将生物纳米复合物电聚合在金电极表面。纳米离子的介入大大提高了传感器的灵敏度，是没有纳米离子时的5.8倍，且同样保持了酶的活性和高负载量，传感器拥有高灵敏度和宽的线性范围。

1.5.2 链接化学（Click Chemistry）

“Click”化学是2001年美国著名的Scripps研究院（The Scripps Research Institute）的诺贝尔化学奖得主sharpless(sharpless K.Barry)小组提出的一种模块化方法[23]。其所具有的高效和高控制性，在化学合成领域掀起了一场风暴，成为目前国际医药领域最吸引人的发展方向，被业界认为是未来加快新药研发最有效的技术之一。一价铜催化的叠氮化物和端基炔的1，3-偶极环加成反应是所有“click”化学反应中最具代表性的一个。该方法主要通过Cu(Ⅰ)催化叠氮化合物和末端炔反应生成单一的反式三氮唑分子。此反应不仅具有高度的独立性、完整性和专一化程度，而且还有很好的生物兼容性[24]。此外，反应产物在生理条件下极其稳定。由于这些引人注目的优点，“click”化学在众多研究领域得到了迅速发展[25～27]。 但到目前为止，将“click”化学应用于生物传感器领域还鲜有报道。

Brennan等[28]利 用 “click”化 学 将 脂 肪 酶（Lipases）和纳米金进行生物耦合。首先将纳米金叠氮化，同时脂肪酶炔基化，两者在Cu(Ⅰ)的催化作用下，发生“click”反应。反应生成的产物用毛细管电泳法和荧光法进行了详细的研究，结果表明：一个纳米颗粒上链接七个充满活性的脂肪酶蛋白分子。Gole科研组[29]也雇佣了“Click”化学将金纳米棒和胰岛素进行交联耦合。首先用11-叠氮-3,6,9-三氧杂十一烷-1-氨基 （NH2-PEGN3）将金纳米棒叠氮化，用戊炔酸将胰岛素炔基化，然后在 Cu(Ⅰ)的催化作用下，发生“click”耦合。并且该工作中同时还采用了EDC交联法和直接吸附法对其进行了比较研究，结果显示：“Click”耦合酶的生物活性远远超过了两种常用的方法。Jin Litong实验小组[30]对“click”反应的方法进行了延伸的研究，就这种方法用在生物传感器的研制当中。先将咪唑-1-磺酰叠盐酸自组装在金电极表面，得到了炔基端基的修饰层，然后，再在Cu(Ⅰ)的催化作用下，和叠氮化的HRP发生“click”反应。电极的组装过程运用红外光谱法和表面增强拉曼散射光谱进行了详细的研究。所用的试验结果说明固定在电极表面的HRP分子维持了较高的生物活性，没有发生酶自身结构的变性。酶与电极之间的异质电子传输常数为1.11 s-1，表观米氏常数为 0.196 mmol·L-1。 暗示了酶与底物间具有较高的亲和作用。

大量的试验结果表明，这些技术都存在着各自的优缺点，因此，通常会将这些方法进行联用，互相协同改进，以获取传感器最佳的性能。但是无论使用何种方法，都必须兼顾酶蛋白生物活性的保持与固载后的稳定性和耐用性。

2 纳米材料在电化学酶生物传感器中的应用

纳米技术的兴起已经为电化学生物传感器的研究开辟了一片新的天地。利用纳米材料特异的电学、光学和化学性质，主要起到以下几种作用：a.加快电子转移速率，增加氧化还原物质在电极表面反应的可逆性；b.催化反应；c.固定生物分子；d.标记生物分子；e.反应控制开关；f.作为反应物。它的引入不仅可以增加酶的吸附量和稳定性，而且还可以提高酶的催化活性，使酶电极的电流响应灵敏度得到显著提高。目前，随着纳米技术的不断提高，各种形状和结构的纳米材料已经被成功制备。下面将主要介绍几种常见的纳米材料作为电极界面修饰材料方面的研究应用。

2.1 碳纳米材料在生物传感器中的应用

碳纳米材料是指分散相尺度至少有一维小于100 nm的碳材料。近年来，碳纳米技术的研究相当活跃，多种多样的纳米碳结晶、针状、棒状、桶装等形貌层出不穷。它具有环境友好、比表面积大以及优良的物理和化学性质而备受人们的青睐[31]。目前，碳纳米管、碳纳米纤维、石墨烯等形貌新颖、功能优异的碳材料已相继问世，并在生物传感领域得到了广泛的应用[32～33]。

2.1.1 碳纳米管修饰的生物传感器

碳纳米管(Carbon nanotubes，CNTs)，属富勒碳系，是伴随着C60的研究不断深入才发现的。是继石墨、金刚石和C60之后的又一种碳的同素异形体。CNTs是由碳六元环构成的类石墨平面卷曲而成的纳米级中空管，以碳原子sp2杂化为主，混sp3杂化所构筑成的理想结构，具有纳米尺度形成的细微结构。CNTs具有特殊的电学性质，其导电性既具有半导体性质又具有金属性质，因此修饰在CNTs表面的酶蛋白分子可表现出更快的电子传递速率[34]，因此是固酶的理想材料。再一，CNTs特殊的中空管状结构具有较大的比表面积，经酸处理后的CNTs具有更多的活性位点，其上的羧基容易与蛋白质上的氨基结合，因而利用CNTs固载蛋白分子可以增加其固定量，从而增强反应信号。另外，由于碳纳米管具有巨大的分子量，直接导致碳纳米管的不可溶解性。在用于制备修饰电极时，通常将其和某种溶剂超声分散得到相对稳定的胶状悬浮液。最常用的分散剂有壳聚糖、Nafion、离子液体以及聚电解质等等。随着研究的不断深入，现在趋向于将两种或两种以上的分散剂一起和CNTs混合，来增加其生物兼容、不溶胀等性质。

Lee Kwangpill等[35]用壳聚糖和离子液体一起来分散碳纳米管，利用壳聚糖和离子液体的成膜作用，在其氨基的界面上组装纳米金，然后利用纳米颗粒和葡萄糖氧化酶之间的作用将酶固定在电极表面。基于几种物质的协同作用，所研制的传感器具有高的灵敏度和较快的响应时间。Cai Chenxin 等[36]将碳纳米管（CNTs）与聚苯乙烯磺酸钠（PSS）、离子液体（ILs）和邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯（PDDA）相混合，制备了新颖的葡萄糖生物传感器。

2.1.2 石墨烯修饰的生物传感器

石墨烯是由碳原子构成的二维晶体，碳原子排列与石墨的单原子层一样。石墨烯的理论研究已有60多年的历史，被广泛用来描述不同结构碳质材料的性能[37]。石墨烯是目前已知的导电性能最出色的材料，其良好的导电性能和宏观隧道效应能使其成为固定化酶和电极之间有效的电子传导体，因而可以提高传感器的灵敏度和响应电流，缩短响应时间，提高检出限。并且石墨烯还具有良好的生物相容性，有利于生物蛋白活性的保持，非常有利于生物敏感膜的固定，因此石墨烯在生物传感领域有很广阔的应用前景。近来，石墨烯在生物传感器中应用研究正日新月异的进行着[38～39]。

Qu Xiaogang研究组[40]利用比色法检测了吸附在羧基化的氧化石墨烯 （GO-COOH）表面的GOD对葡萄糖的催化性能。GO-COOH拥有高的比表面积和对底物有较好的亲和性。试验还发现GO-COOH有类过氧化物酶的性质，能对过氧化氢进行催化。

2.2 金属纳米粒子在生物传感器中的应用

金属纳米材料由于具有较高的比表面积、稳定性、较好的生物相容性等特点，己被广泛应用于生物成像、催化剂、燃料电池以及生物传感器等领域[41～44]。

具体来讲，金属纳米离子可分为贵金属纳米离子和半导体纳米颗粒。在诸多的纳米粒子中，贵金属纳米离子（Au、Ag、Pt）在生物传感器中的应用得到了非常广泛和深入的研究。尤其是对纳米金的应用研究。主要集中在利用金纳米粒子做探针载体和信号分子。主要原因为：a.纳米金颗粒可由氯金酸和柠檬酸钠这两种普通试剂合成，在反应过程中，可以通过调节反应物比例来控制纳米粒子的直径。即金纳米粒子的尺度可控性强；b.由于其直径在1～100 nm之间，而大多数重要的生物分子（如蛋白质、核酸等）的尺寸都在这个范围内，因此可以利用纳米金作为探针进入生物分子内部，扮演“分子导线”的角色，缩短酶分子活性中心与电极表面的距离，起到了加快异相界面电子传递速率的作用，增加了氧化还原物质在电极表面反应的可逆性。所以能够更好的探测生物分子的生理功能，进而在分子水平上揭示生命过程。此外，金纳米粒子与巯基、氨基、氰基等基团之间能发生强的共价键合作用，这使得金纳米粒子与生物活性分子可结合形成生物分子探针[45]。蛋白质分子也可以通过静电作用和疏水作用结合到纳米金的表面，形成的复合物能够长久的保持蛋白质的生物活性[46]。例如：Willner Itamar研究组[47]研究了将1.4 nm小粒径的纳米金粒子（nano-Au）与葡萄糖氧化酶（GOD）的辅因子-黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）相连，通过双巯基分子将nano-Au-FAD组装到金电极表面。然后与除去辅因子的GOD重组为新的GOD相结合。该电极成功地实现了酶的直接电子传输。在测定葡萄糖时，酶与电极之间通过金纳米粒子传递电子，电子传输速率常数（ks）为5×10-3s-1。 其电子传递速率是天然酶与其天然底物氧之间电子传递速率的7倍。由于金纳米粒子传递电子的速率远快于氧，并且该传感器在测定葡萄糖时不受溶解氧浓度的影响，还具有很好的抗干扰能力。通常用柠檬酸根还原法制备的纳米金是带负电荷的，很少研究者注意到带正电荷的纳米金。实际上，正电荷的纳米金对蛋白质具有更强的吸附作用力和更好的催化性能。Yuan Ruo课题组[48]在有机相中合成了正电荷的纳米金，并将其和血红蛋白进行层层组装研制了过氧化氢生物传感器。另外，也将正电荷的纳米金和葡萄糖氧化酶进行结合，对葡萄糖进行定量检测[49]。该纳米离子研制的传感器具有线性范围宽、检测限低，以及灵敏度高等优点。

随着对纳米离子研究的不断深入，各种各样形状和形态的贵金属纳米离子已经被成功制备，并用于对生物传感器的研制过程中。Yuan Ruo课题组[50～51]合成了空心的铂纳米链、空心的铂钴纳米链，结合多孔状的纳米金和碳纳米管，实现了对葡萄糖的定量测定。

2.3 SiO2纳米粒子在生物传感器中的应用

除了贵金属纳米粒子之外，二氧化硅溶胶也较早地被引入到固定化酶的研究。通常情况下，纳米SiO2的粒径小于100 nm，通常为20～60 nm。像其它纳米材料一样，纳米SiO2表面都存在不饱和的残键以及不同键合状态的羟基，表面因缺氧而偏离了稳态的硅氧结构[52]。所以，纳米SiO2才具有很高的活性，较强的吸附性能，以及对酶的稳定保护作用，为固定化酶提供了优良的反应场所，增加了固定化酶的稳定性和活性，而具有很广泛的用途。比如：Sun Changqing研究小组[53]制备了氨基修饰的纳米SiO2粒子，再以戊二醛为偶联试剂，通过层层自组装技术将氨基化的纳米SiO2粒子与GOD多层膜修饰到电极表面。实验结果表明，通过组装四层纳米SiO2/GOD后，制成葡萄糖生物传感器具有最优的响应性能，其灵敏度为 5.11 μA·L·mmol-1·cm-2， 检测限为 9×10-6mol·L-1。近年来，SiO2纳米粒子被制备成核壳型的纳米球，以及将SiO2纳米粒子功能化，形成具有氧化还原电活性的复合纳米离子已成为发展趋势。例如：Yuan Ruo课题组[54]合成了有机硅纳米球，用于对HRP的直接固定。还将此硅纳米球和普鲁士蓝（PB）反应，制备了普鲁士蓝修饰的硅纳米球[49]，该纳米复合材料除作为酶的固载基质之外，还具有很好的氧化还原活性，并且可以有效的防止PB的渗漏。

2.4 磁性纳米材料在生物传感器中的应用

磁性纳米颗粒是近年来刚刚发展起来的一种新型材料，一般是指颗粒尺寸在1～100 nm范围内的超微磁性粒子。磁性纳米粒子不但具有普通纳米粒子所具有的四个基本效应，还具有异常的磁学性质，如超顺磁性、高矫顽力、低居里温度与高磁化率等特性，引起了人们广泛的关注。而以Fe，Co，Ni等金属元素为基体元素形成的纳米尺寸微粒还具有奇异的超顺磁性等特性，如纳米Fe，Fe2O3，Fe3O4，Fe/Pt等。 其中 Fe3O4是应用最多的磁性纳米颗粒，它很容易在水溶液中通过共沉淀或氧化共沉淀制备，其粒度、形状和组成可以通过调节反应条件得到控制。磁性纳米颗粒除了具有纳米磁学的特性之外，还具有生物相容性、表面活性等优异性能。使其在核酸分析、临床诊断、靶向药物、细胞分离和酶的固定化等领域有着广泛的应用研究[55～56]。在生物传感器领域,磁性纳米颗粒的应用为生物传感器开辟了广阔的前景，磁性纳米颗粒能显著提高生物传感器检测的灵敏度，实现生物分子的分离，提高了检测的通量。

磁性纳米颗粒固酶技术是上世纪60年代开始发展起来的一项新技术。具有三大优势：a.作为酶的固定化载体，磁性纳米粒子有利于固定化酶从反应体系中分离和回收，还可以利用外部磁场控制磁性材料固定化酶的运动和方向，提高固定化酶的催化效率;b.固定化酶可重复使用，降低成本，可以提高酶的稳定性，改善酶的生物相容性、免疫活性、亲疏水性；c.分离及回收酶的操作简单，适合大规模连续化操作[57]。Rossi等[58]合成了20 nm的Fe3O4纳米粒子，并对Fe3O4进行氨基化，然后通过戊二醛将葡萄糖氧化酶共价交联在纳米粒子表面。结果表明，Fe3O4增加了固定化酶的稳定性和保持了酶的生物活性，于4℃下保存，3个月内其生物活性未见明显变化。检测葡萄糖的结果令人满意。

另外，磁性纳米材料由于其特殊的磁性和良好的物理化学性质，可以选择性测定待测物质及控制电催化过程，因此常用作电极表面的反应控制开关。Wang Joseph等[59]通过改变外部磁铁的位置来转化和控制电催化过程，他们将二茂铁、葡萄糖氧化酶电活性物质固定在修饰金/镍纳米线的表面，以二茂铁为电化学探针，通过改变外加磁铁的位置来控制磁性粒子的电化学活性。

2.5 纳米材料应用在生物传感器中的发展趋势

随着纳米技术的迅速发展，各种纳米材料已广泛用于生物传感器的研发。现如今，纳米复合材料已成为当今发展的趋势。简言之，纳米复合材料是将各种纳米粒子以及其它组分通过物理或化学的方法，有机结合形成的新型的复合纳米材料，它除具备各组分本身的性质外还可能具备特有的性质。

Yuan Ruo课题组[60]将铂纳米离子负载在碳纳米管表面，形成铂功能化的碳纳米管复合材料，利用其良好的电催化性质和增强电子传输的能力，作为固酶基质，实现葡萄糖氧化酶的直接电催化。Mirkin等[61]采用新的方法合成了金壳、硅核和Fe3O4为夹层的三层磁性复合纳米颗粒。并对DNA进行功能化，研究结果表明：这种结构的纳米复合物显示了彼此间很强的协同作用，并且有望用于高选择性的生物诊断体系。

最近，纳米金属与CNTs相结合成为研究的热点。这主要是由于CNTs具有较高的比表面和催化活性，使得纳米金属具有较高的分散性，导致这种复合纳米材料具有很好的催化活性和稳定性。将这种复合材料用于生物传感器的研制中，能够发挥其良好的协同作用，使得传感器的活性面积进一步增加，更加稳定，而且灵敏度更高、选择性更好并具有良好的重现性等。例如：Yuan Ruo课题组[62]制备了金铂合金功能化的硅纳米纤维复合材料。通过对硅纳米纤维表面的氨基吸附纳米金，再利用吸附的纳米金为晶核，利用抗坏血酸（AA）将H2PtCl6还原，得到Pt-Au核壳型合金功能化的硅纳米纤维复合纳米颗粒。利用多种纳米材料的协同作用制备的修饰电极，具有高的比表面积和促进电子的传输，可以实现对葡萄糖灵敏、快速的测定。Qian Weiping实验组[63]合成了以SiO2为核，金为壳的复合纳米离子（GNSs），并将其自组装在氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）修饰的ITO电极表面，再去吸附血红蛋白（Hb）。制备的传感器拥有较宽的线性范围，低的检测限以及对底物有较强的亲和力。而且，GNSs增强了酶与电极之间的直接电子传输。

总之，纳米颗粒大大丰富了生物传感器的研究内容，纳米颗粒-酶组装的体系是最有发展前景的传感器之一。基于纳米颗粒的种类繁多，制备和形貌控制方法较为完善，生物兼容性好等优点，纳米颗粒在生物传感器领域必将发挥越来越大的作用。另外，纳米颗粒也可作为多组分酶中继体的体系，具有潜在的发展前景。

3 展望

纳米技术的介入为生物传感器带来了无限的发展空间，由于纳米技术和表征手段的日趋成熟，纳米电化学生物传感器正呈现日新月异的变化。但是，生物传感器在实用性和耐用性方面仍存在着严峻的挑战。今后，探索和开发更易于固定酶和促进电子转移的新纳米材料，以及寻找方便、高效的酶固定化方法、研制开发性能优异、可靠、实用高效的生物传感器,将是科研工作者继续努力的方向。

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