胸苷酸合成酶多态性与非小细胞肺癌易感性及淋巴结转移的关联性研究

洪雷 崔雅静 姜达 李琰 郭炜 王娜 张健慧

人类胸苷酸合成酶(thymidylate synthase，TS)是由两个相同亚单位组成的二聚体蛋白，其基因定位于第18号染色体上(18p11.32)［1］。TS是DNA生物合成的关键酶，它催化单磷酸去氧尿苷(dUMP)甲基化，使之转变为一磷酸脱氧胸苷(dTMP)。TS活性的抑制将直接影响DNA的合成和细胞的分裂增值，因此TS是以叶酸为基础的TS抑制剂化疗中的一个理想靶点［2］。另外，胸苷酸合成反应与蛋氨酸、叶酸代谢反应偶联，对DNA的甲基化和DNA的合成与修复有重要影响［3］。而个体的DNA甲基化水平以及DNA修复能力与肿瘤的发生发展有明显的相关性。许多研究表明TS的表达强度与肿瘤的恶性生物学行为密切相关［2］。TS高表达者的增殖抗原表达、血管侵犯、远隔转移率明显高于TS表达低者，因此TS高表达很可能对预测肿瘤的发生、发展甚至远处迁徙具有重要作用。本文通过采用PCR-RFLP技术，检测研究对象的TS多态性基因型，探讨TS基因多态性与非小细胞肺癌发生及其淋巴结转移的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择病理诊断明确的非小细胞肺癌(NSCLC)患者177例作为NSCLC组。同时选择同一医院同一时期体检人员381例作为对照组。2组患者均来自河北省南部非高发区并均为汉族。手术患者的淋巴结转移信息来自手术记录。

1.2 标本采集及DNA的提取 采集静脉血5ml，经枸橼酸钠抗凝，置4℃保存，并于采血后1周内，以蛋白酶K消化—饱和氯化钠盐析法提取外周血单核细胞DNA。

1.3 TS 5’UTR和3’UTR多态性位点基因分型 TS 5’UTR多态重复序列基因型检测采用聚合酶链反应(PCR)分析方法进行。PCR反应体积为25 μl，其中模板DNA100 ng，10×PCR缓冲液 2.5 μl，1.5 mmolmgCl2，1 U Taq-DNA 聚合酶，dNTPs 200 μmol，TS 5’UTR 上游引物 (5’-GTGGCTCCTGCGTTTCCCCC-3’)和下游引物(5’-GGCTCCGAGCCGGCCACAGGCATGGCGCGG-3’)［4］各 200 nmol。PCR 反应条件为:94℃ 预变性5min，然后94℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 30 s，35 个循环后72℃延伸10min。反应产物进行3%的琼脂糖凝胶电泳分析。预期2R、3R等位基因扩增产物分别为243 bp和215 bp。使用HaeIⅡ酶切对3R等位基因G→C SNP进行分型。酶切产物进行4% 的琼脂糖电泳分析，含 66-，47-，45-，44-，28-和 13-bp 片段的为 3G 等位基因，含 94-，47-，45-，44-和 13-bp 片段的为 3C 等位基因。

TS 3’UTR 6 bp核苷酸片段的缺失或插入多态性分析采用PCR-RFLP 方法［5］。模板 DNA 100 ng，10 × PCR 缓冲液2.0 μl，1.5 mmolmgCl2，1 U Taq-DNA 聚合酶，dNTPs 200 μmol，TS 5’UTR上游引物(5’-CAAATCTGAGGGAGCTGAGT-3’)和下游引物 (5’-CAGATAAGTGGCAGTACAGA-3’)各 150 μmmol/L。PCR 反应条件为:94℃预变性5min，然后94°C 30 s，58°C 45 s，72°C 45 s，30个循环后，72°C 延伸 5min。PCR 产物经限制性内切酶DraⅠ于37°C消化12 h后，反应产物进行3%的琼脂糖凝胶电泳分析基因型。有6 bp插入等位基因(6bp+)显示70和88 bp片段，无6bp插入等位基因(6bp－)显示152 bp片段。

每一组PCR反应都做一个阴性对照，用去离子水代替DNA摸板进行扩增。随机取10%的标本重复PCR反应来进行实验的质量控制。

1.4 DNA序列分析 对6个有代表性的标本进行TS 5’UTR基因型测序。杂合型的标本从琼脂糖中切取相应条带后以DNA纯化试剂盒进行纯化，再行PCR扩增等位基因型产物。以ABI 377型测序仪行DNA序列测定。

1.5 统计学分析 应用SPSS 10.0统计软件，经比较各位点基因型频率的观察值与预期值并进行χ2检验，同时进行Hardy-Weinberg平衡分析，2组的基因型分布比较采用行×列表卡方检验，2组的单体型频率计算及分布比较采用EH软件(1.2 version，Rockefeller University，New York)进行，以非条件 Logistic回归法计算表示相对风险度的比值比(odds ratio，OR)及其95%可信区间(confidence interval，CI)，频率比较行χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 吸烟及家族史对NSCLC易感性的影响 NSCLC组吸烟者比例(59.9%)明显高于健康组(39.9%)(P ＜0.01经性别年龄调整 OR=2.24，95%CI=1.05～ 3.35)。家族史阳性者(14.7%)显著高于对照组(4.6%)(χ2=8.62，P=0.003)。

2.2 对照组中TS基因多态性分布 TS 5’UTR基因分型结果显示出4种 PCR 片段，约为210、240、270、300 bp。测序结果证实分别代表相同28 bp的2(2R)，3(3R)，4(4R)和5(5R)次重复等位基因，形成 2R/2R，2R/3R，3R/3R，2R/4R，3R/4R，2R/5R和3R/5R七种基因型。含有3R等位基因个体进一步分析G→C SNP，28bp重复序列多态和G→C SNP联合确定TS 5’UTR多态性。对照组中5’UTR的等位基因频率分别为33.7%(3G)，45.0%(3C)，20.4%(2R)和 0.9%(4R 和 5R);基因型频率分别为 16.5%(3G/3G)，21.8%(3G/3C)，24.7%(3C/3C)，12.1%(2R/3G)，18.4%(2R/3C)和 4.7%(2R/2R)，其中2R/4R(0.3%)，3C/4R(0%)，2R/5R(0.5%)和 3R/5R(0)基因型在中国北方人口中出现频率较少。TS 3’UTR 6bp缺失或插入基因型检测:对照组中6bp－/6bp－、6bp+/6bp－和6bp+/6bp+基因型频率分别为45.4%，45%和9.2%;6bp+和6bp－等位基因频率分别为68.0%和32.0%。两种TS多态性基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P ＞0.05)，在对照组中的基因型分布与年龄、性别、吸烟状态无关。单倍体分析显示6bp－/3C在正常对照中出现频率最高(30.7%)，其他依次为 6bp －/3G(26.8%)，6bp+/3C(15.8%)，6bp+/2R(8.5%)，6bp － /2R(17.2%)，6bp+/3G(4.0%)。采用 EH软件进行连锁不平衡的分析结果显示，与其他一些人口相同［5，6］，TS 5’UTR 和3’UTR 多态性在中国北方人口中存在明显连锁不平衡(D’=0.26，χ2=37.35，P ＜0.01)。6bp － 等位基因易与3R(3G或3C)等位基因连锁。

2.3 NSCLC组与对照组中TS基因5’UTR和3’UTR基因型和等位基因型多态性分布比较 5’UTR和3’UTR的各基因型、等位基因型单独分析在地2组中差异无统计学意义(P＞0.05)。但当我们联合TS 5’UTR和3’UTR基因型进行分析时发现:同时携带3C/3C及6bp+/6bp+基因型的个体患NSCLC的危险性显著低于携带其他基因型组合的个体(年龄、性别校正 OR=0.25，95%CI=0.06-0.95)。

2.4 TS单体型对NSCLC易感性的影响 单体型总体分布在NSCLC组中与对照组中差异无统计学意义(P＞0.05)。然而，6bp+/2R单体型在NSCLC患者组出现频率(8.5%)显著低于健康对照组(13.0%)(χ2=5.034，P=0.025)。6bp+/2R单倍体型显著减低NSCLC的发病危险性(OR=0.5895 %CI=0.26～0.93)。

2.5 TS基因多态性与淋巴结转移 在有肿瘤侵润深度和淋巴结转移资料的116例NSCLC患者中，未观察到TS 5’UTR及3’UTR多态性与淋巴结转移相关(P ＞0.05)。

3 讨论

TS基因是多态的，TS基因多态性与多种肿瘤的预后、化疗敏感性甚至化疗毒性相关。TS基因5’端转录启始点上游存在一28 bp多态性重复序列，其重复次数包括两次(2R)、三次(3R)或更多次数［7］;Shintani Y 等［8］发现，在 70 例Ⅰ期和Ⅱ期非小细胞肺癌患者中，3R/3R基因型肺癌组织表达水平以及蛋白水平较2R/2R，2R/3R高。虽然迄今为止众学者在TS5’端基因型是否与mRNA转录水平相关的问题上还存在分歧［9，10］，但体内外研究显示，3R等位基因型的蛋白表达效率均高于2R［4，11］。在3R的第二次重复序列存在G→C的单核苷酸多态(single nucleotide polymorphism，SNP)。含G的3R序列(3G)表达效率较含有C的3R序列和2R序列高3～4倍［12，13］。3G基因型与TS mRNA高表达有关［5］。另外，在TS mRNA3’非编码区的1494b处存在6 bp核苷酸片段的缺失或插入［14］;报道显示，6 bp缺失的等位基因型 (6bp－)在体内减低mRNA的稳定性，在体外使肿瘤细胞TS表达水平降低［6，15］。

NSCLC约占肺癌患者的80%，其中2/3的患者确诊时已失去手术机会［16，17］。而且，传统的诊断在方法上和诊断意义上还不能满足我们临床人员进行广泛普查、早期诊断、临床观察和随访。因此，找到行而有效的早期诊断手段以及检测综合治疗敏感与否的指标是当今NSCLC研究的一个重要课题。

吸烟可能会使血液中的B族维生素包括叶酸的水平降低，而低叶酸水平是引起DNA链断裂，导致遗传物质不稳定和癌症风险增加的关键因素［18］。而某一类人群易于受到某些有害物质的侵扰患病，而把这种体质传给下一代，这种现象被称之为遗传易感性。虽说环境以及遗传因素在肺癌发病过程中不是直接病因，但是它被认为是重要的促进因素。正如本研究结果，吸烟以及家族史阳性者患NSCLC的危险性明显增加。

胸苷酸合成酶多态性基因与肿瘤易感性相关［19－22］。TS高表达的个体对肿瘤易感，而TS基因型多态性能够影响TS蛋白表达和mRNA表达水平，因此TS基因型多态很有可能是我们评估肿瘤易感的重要指标。但是我们的研究结果显示，无论是5’UTR重复序列多态，SNP还是3’UTR插入或缺失多态都不单独影响个体对NSCLC的易感性。然而当我们联合5’UTR和3’UTR多态性基因型进行分析发现:与同时携带6bp－/6bp－/3G/3G基因型的个体相比，同时携带3C/3C及6bp+/6bp+基因型的个体患NSCLC的危险性要降低4倍。根据现有资料，3C单体型基因表达效率比3G单体型要低，而且目前多数认为6bp+单体型个体体内TS mRNA稳定性和蛋白表达率要高于其他各基因型。TS活性增加可以给支气管上皮细胞提供充足的核苷酸原料，加速支气管上皮的新陈代谢，从而实现对支气管上皮的保护作用，那么我们的结果是与目前大多数的研究结果是相吻合的。但是，当分析TS单体型联合作用与NSCLC易感性是否相关时，我们并没有得到6bp+/3C单体型可以降低NSCLC发病危险性的预期结果，而发现6bp+/2R单体型在减少NSCLC发病危险上有显著意义。6bp+/2R单体型包含一个引起TS低表达的2R等位基因和一个引起TS高表达的6bp+等位基因，而结果是显著降低NSCLC发病危险性。我们考虑:(1)TS 5’UTR和3’UTR多态性联合对TS转录和翻译的影响并不是一个简单的加合作用，而且我们也很难用简单的加减来解释;(2)多态性基因型能否影响基因三维构象从而影响基因功能尚需进一步探讨;(3)环境-基因之间的相互作用非常复杂，它不是单基因的作用而是多基因的联合作用;(4)当然，这也有可能是由于样本量小而出现的一个偶然结果，我们会加大样本量进一步验证;(5)进一步扩大样本量，对不同病理类型进行分层分析的结果值得期待。另外，由于我们这项研究中因为缺乏组织标本，因此未加入对TSmRNA转录及其稳定性和蛋白表达的检测。我们通过对116例由淋巴结转移资料患者TS多态的观察，未发现TS 5’UTR及3’UTR多态性与淋巴结转移相关(P ＞0.05)，这与 Miyamoto等［22］的研究结果相符。

总之，TS 5’UTR重复序列多态性、SNP和3’UTR缺失多态性联合分析可作为预测NSCLC易感性的标志，而TS 5’UTR及3’UTR多态性与中国北方人群肺非小细胞癌淋巴结转移无关。

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