EDTA-K 2抗凝末梢血不同检测时间对血小板计数结果的影响

梁委军，董家书

（广西医科大学第四附属医院柳州市工人医院检验科，广西 柳州 545005）

国际血液学标准委员会(ICSH)推荐使用乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)作为血细胞分析的抗凝剂广泛使用于各个医院，我们在实际工作中发现一些标本在采集样本混匀后立即检测血小板计数结果假性减少，低于100 g/L，而在混匀后再次检测结果又在正常范围内，为探讨其假性减少原因及采取解决对策，我们对2010年6月至2011年5月收集的62例标本进行采样混匀后分别进行即时检测、2 min检测、5 min检测、10 min检测，15～30 min检测，同时以手工计数法为参照，评估仪器法在采血后不同时间检测血小板计数的准确性，现报道如下：

1 材料与方法

1.1 材料 ①仪器及试剂Sysmex XS-800I血液分析仪，试剂为Sysmex配套产品，定期参加卫生部临检中心及区临检中心室间质评，每日检测之前仪器常规保养，本底计数正常，低、中两个批号的质控品检测在控；EDTA-K2抗凝管，江苏康健医疗用品有限公司生产；一次性采血管，规格100μl，山东省成武县医用制品厂；手工法血小板稀释液(草酸铵液)，参照《全国临床检验操作规程》[1]第3版配制。②样本62例末梢血标本来自门诊病人，年龄7个月～76岁，男30例，女32例。

1.2 方法 用75%酒精消毒患者无名指，用一次性采血针刺破皮肤，拭去第一滴血后分别用一次性采血管(规格20 μl，100 μl)采集20 μl、满管血样分别置于0.38 ml手工血小板稀释液中和EDTA-K2抗凝微管中并混匀，用XS-800I血细胞分析仪对经EDTA-K2抗凝并混匀的末梢血标本进行即时检测、2 min检测、5 min检测、10 min检测、15～30 min检测，分析血小板计数结果；手工计数方法严格参照《全国临床检验操作规程》第3版进行，于30 min内完成，将仪器法计数结果与手工计数结果比较。

1.3 统计学方法 取各组参数的均数作统计学分析，以均数±标准差(±s)表示，采用方差分析，SPSS11.5统计学软件进行数据处理。

2 结果

EDTA-K2抗凝末梢血不同检测时间血小板计数结果分别为：即时检测(142.71±57.45)×109；2 min检测(206.65±78.04)×109；5 min检测(203.08±82.52)×109；10 min检测(211.56±68.85)×109；15～30 min检测(200.66±70.20)×109；手工计数结果为(211.35±80.36)×109；经方差分析，即时组与其他不同时间组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)，与手工计数比较，差异有统计学意义(P＜0.01)；其他不同时间组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)，与手工计数比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

3 讨论

血细胞分析仪计数血小板具有快速、简便、重复性好等优点，然而由于血小板易于粘附、聚集、破坏等诸多因素，导致血细胞分析仪测定血小板时常会出现假性减少，血小板可逆聚集[2]就是其中的一种，如不注意，易诱导临床误诊误治，甚至引起医疗纠纷。本文数据表明，采血混匀后立即经XS-800I血液分析仪测定，血小板计数结果明显偏低，与手工计数法及其他时间检测的结果比较差异有统计学意义(P＜0.01)，分析原因：可能与血小板可逆聚集体的形成有关。当血管壁受损后，会暴露出管壁的内皮表面，内皮细胞表面表达的活性物质和分泌释放入血的活性成分迅即激活血小板，使活化的血小板表面糖蛋白成分、含量和构象都发生了变化，由静息状态的圆盘状转变成骨架蛋白滑动后出现的多角形或多伪足形活化状态[3]，诱导血小板聚集，这种由组织释放的二磷酸腺苷(ADP)引起的第一时相为可逆性聚集；再者，新鲜末梢血离体后加入到EDTA-K2抗凝管中时，一定浓度的EDTA-K2络合了血液中的钙，在接触血液后瞬间完全溶解，导致抗凝管内壁周围全血的外环境及温度发生改变，血小板一旦与经过特殊处理的抗凝管内壁等非血管内膜表面接触，即迅速扩展，颗粒向中央集中，血小板外膜形成的微小管游离端向外伸展，或因机动蛋白纤维丝向中心方向延长时遇到阻力而产生膜外方向的反作用推力，从而在血小板周围形成多个丝状伪足，使血小板形态发生变化，由正常两面微凸的圆盘状变为扁平伸展形，并出现明显的胞浆突起使细胞变成有不规则“伪足”状外突的树突型血小板，数个伪足相互缠绕形成血小板聚集体[4]。

分析仪检测血小板时以电阻脉冲形式计入，采血后立即检测由于血小板发生聚集，其可逆聚集体不被溶血剂溶解，聚集体所产生的脉冲大于仪器预设的血小板脉冲值，血小板不被计入其结果内或误把一堆血小板计数成一个血小板，导致血小板数量暂时假性减少。钟素萍等[5]曾报道，血标本在采集后0.5 min检测，血小板(PLT)计数值与手工计数差异显著。由于树突型血小板及时消除其刺激因素还能变成循环型血小板，采血过程中形成的血小板聚集体由于脱离了创伤面与抗凝剂结合，并经操作者反复振荡，通过振荡这种物理作用，打散了血小板与血小板之间的粘附，使血小板聚集团松散进而解聚，大团块变成几个小团块甚至瓦解，释放粘附其中的血小板。汪兆亮等[6]报道末梢血混匀程度与静置时间对血小板计数结果有很大影响，通过对末梢血采集后不振荡立即检测和充分振荡混匀静置5 min后检测结果进行分析，结果显示未振荡的计数值与充分振荡混匀静置5 min后的计数值差别甚大，前者比后者平均低30×109/L左右，认为充分摇匀之后上机检测结果稳定性较好；而与抗凝剂络合形成的聚集体随着时间的延长及血液与抗凝剂的充分混匀，乙二胺四乙酸盐使血小板由盘状变为球状，血小板伪足回缩到细胞质内，相互缠绕的血小板解散[7]，故在采血混匀2～30 min后进行血细胞分析，可得到更加靠近真值的血小板计数结果，可提高结果准确性。

实际操作中，门诊患者(尤其是夜间急诊患者)由于急需报告，检验人员通常会尽可能快地检测，使标本待测时间缩短，导致血小板结果偏低。本实验中，第一次检测发现血小板计数结果低于100 g/L的有11例；其中再次检测结果正常的标本有9例，占14.5%；2例再次检测结果仍低于100 g/L，但较第一次检测结果要高，1例再次检测无变化，可认为是真性减少；其余52例第一次检测血小板虽然＞100 g/L，但与再次检测后血小板计数结果相比，结果普遍都偏低。而充分混匀2 min后检测与0.5 h内检测结果无太大差异，与手工计数法也无明显差别，可见EDTA-K2抗凝末梢血在充分混匀2 min后检测血小板数可基本消除血小板可逆性聚集的影响，因此末梢血采集后尽可能充分混匀两分钟后再检测。值得一提的是，这种现象在冬天较为明显，可能是血液与冰冷的抗凝剂接触后温度骤然降低，引起冷凝集所致，在影响血小板计数的因素中，冷凝集因素[8-9]也是其中之一。因此在遇到此类问题时最好重复检测，必要时涂片镜检，避免血小板计数假性减少，给临床造成极大的困扰。

[1]叶应妩,王毓三,申子瑜.全国临床检验操作规程[M].3版.南京:东南大学出版社,2006:10.

[2]李胜发,程大林.血小板可逆聚集在全血细胞分析中的影响[J].临床检验杂志,2003,21(1):37.

[3]许文荣,王建中.临床血液血与检验[M].4版.北京:人民卫生出版社,2007:339.

[4]申志红,杨宇溪.血小板可逆聚集致血细胞分析仪误报血小板减少[J].临床误诊误治,2008,21(10):73.

[5]钟素萍,马粤健.Sysmex KX-21型血细胞分析仪计数血小板的影响因素的探讨[J].海南医学,2007,18(8):132-133.

[6]汪兆亮,蔡敏琪,王湘云.末梢血混匀程度与静置时间对血小板计数的影响[J].西南军医,2006,8(6):51.

[7]丛玉隆.当代血液分析技术与临床[M].北京:人民卫生出版社,1997:33-34.

[8]Kurata Y,Havashi S,Iouzaki K,et al.Four cases of pseudothrombocytopenia due to platelet cold agglutinins[J].Rinsho Ketsueki,2006,47(8):781-786.

[9]Schimmer A,Mody M,Sager M,et al.Platelet cold agglutinins:a flow cytometric analysis[J].Transfus Sci,1998,19(3):217-224.