转基因植物对环境微生物的影响及其检测技术的研究进展

昌艳萍，杨亮，李春青，王华芳

（1.北京林业大学 生物科学与技术学院，北京 100083；2.河北大学 生命科学学院，河北 保定 071002）

转基因植物对环境微生物的影响及其检测技术的研究进展

昌艳萍1，2，杨亮1，李春青2，王华芳1

（1.北京林业大学 生物科学与技术学院，北京 100083；2.河北大学 生命科学学院，河北 保定 071002）

为了解转基因植物及其表达产物环境释放的生态影响，归纳和总结了转基因植物对微生物的影响及其检测技术的应用现状.从转基因植物对土壤微生物多样性的影响及其检测的一般方法和分子生物学方法，转基因植物中抗性标记基因对微生物影响和微生物在转基因植物产品毒理学检测等方面进行了综述，以期为转基因植物的应用和健康发展提供依据，同时也为转基因植物的安全性评价研究提供借鉴.

转基因植物；生物安全；毒理性；土壤微生物；检测技术

转基因植物中包含有来源于不同物种的基因，可以表达出新的性状，使转基因生物体特别是农作物具有某些特定的功能和应用的商业价值［1-2］.转基因植物的成功是人类改造自然的一个标志性成果，但是转基因生物的实际应用和释放带来的安全性隐患，尤其对于生态系统的影响，还是一个认识并不透彻的方面.目前，人们付出了很大努力对转基因作物地上部分的环境生态效应进行了评估，也取得了一些进展，但在转基因作物及其工程菌对土壤微生物群落和活性的影响方面，则研究工作相对较少，主要原因之一是研究土壤微生物存在更大的困难.土壤微生物对土壤营养固定与矿化，有机质的物理和生化降解，对环境状况的反应变化的敏感特性，使其可作为一个地区或历史环境变迁的生物指标，另一方面，转基因植物及其表达产物和工程菌对土壤微生物群落影响的生态安全研究也是转基因植物投放市场风险性评估最重要的内容之一.

微生物种类繁多，生长繁殖快，代谢能力强，对环境影响敏感，与其他生物具有同一套遗传密码，这些特性决定了微生物是环境中最敏感的指示生物之一，其检测技术简便快速并且可行.本文总结了转基因植物对土壤环境中微生物的影响及其检测技术的研究进展，对推进我国转基因植物的健康、可持续发展具有重要的理论和现实意义.

1 转基因植物对土壤微生物种类和数量的影响及其检测

转基因植物在生长过程中和土壤进行着频繁的物质交换，加上转基因植物的分泌产物不断改变周围特别是土壤环境的养分、水分、p H、通气状况及氧化还原电位，从而对转基因植物根际范围内土壤的生物地球化学循环产生了重要影响.这种影响对土壤微生态的影响尚未引起足够的重视，主要是土壤微生物研究存在较大的困难.土壤微生物数量巨大，种类繁多，一直被认为是研究中的黑匣子（black box）［3］.其中，土壤中的细菌和真菌在生物地球化学循环（biogeochemicalcycles，BGC）过程中扮演着非常重要的角色，而且对土壤中有机物质的转换也起着至关重要的作用［4］.转基因作物对土壤生物的影响不仅包括外源基因本身，还包括外源基因所表达的产物及次级代谢产物等［5］.因此，土壤微生物成为转基因作物释放后生态风险性评价的重点对象.

1.1 对土壤微生物多样性影响的直接测定

直接测定土壤微生物多样性，就是利用光学和电子显微系统对土壤样品中的微生物测定丝状微生物的长度或直接测定并计算微生物数目，其结果可以换算成单位面积微生物数目来表示，以此来统计生物量.通过转基因植物及其对照亲本影响范围内的微生物生物量的差异来初步了解转基因林木对土壤微生物种类和数量的影响.这种方法只需要取少量的样品，简单直接，但与微生物所影响的整个资源环境相比，少量样品并不能代表整个自然环境.

1.2 对土壤微生物多样性影响的平板培养方法

另一种传统的微生物多样性群落分析是平板培养方法，其原理是每个活菌在适宜的培养基和良好的生长条件下生长形成肉眼可见的菌落.首先对待测样品进行适当的稀释，以便每一个平板上只能生长一定合适数目的微生物群落，通过特定的表现型或者生物化学性状来分析微生物的多样性.

Oger等［6］对转基因植物对根际细菌的影响进行了研究，结果发现转基因植物可改变根际细菌的生物学环境.王洪兴等［7］的研究表明，在好气条件下，添加克螟稻秸秆土壤中的细菌数量和反硝化细菌的活性明显低于添加非转基因亲本秸秆的土壤；而对真菌的影响则反之.吴伟祥［8］研究也表明，添加克螟稻秸杆的土壤中的真菌数量，在培养后期明显低于添加非转基因亲本秸秆的土壤的相应微生物数量.另一方面，根际分泌物也长期对根际生物起重要影响，转基因植物产生大量的枯枝落叶.钱迎倩等［9］报道，带有几丁质酶的抗真菌的转基因作物可通过残枝落叶的降解和根系分泌物减少土壤中菌根的种群.对转基因植株与非转基因植株根系周围微生物进行了比较，胡建军等［10］初步证明杨树转基因植株未对微生物3大类群的数量有显著影响.

1.3 对土壤微生物检测的BIOLOG鉴定系统

平板上肉眼计数的分类技术检测到环境样品中的只是一小部分微生物，而土壤环境中微生物功能多样性信息对于明确转基因植物土壤环境中微生物群落的作用具有重要意义，从而使得微生物群落的定量描述成为微生物学家面临的另一最艰巨的任务.一种更为简单、更为快速定量分析描述微生物群落功能多样性的方法是以BIOLOG微孔板碳源利用为基础的鉴定方法.该方法由美国的BIOLOG公司于1989年开发成功，并最初应用于纯种微生物鉴定.根据微生物对单一碳源底物的利用能力的差异，当接种菌悬液时，使孔中的氧化反应指示剂四氮唑紫呈现不同程度的紫色，说明其中的一些孔中的营养物质被利用，这样构成了该微生物的特定指纹.刘颖［11］运用BIOLOG法，分析了转基因棉花土壤根际微生物对31种碳底物代谢反应的平均颜色反应（AWCD）值，结果表明：在棉花2叶和5叶期，转基因抗虫棉的根际土壤微生物在代谢特征上与非转基因棉的根际土壤微生物产生了较大差异，转基因棉根际微生物的生理代谢能力明显高于非转基因棉根际微生物；但在11叶期，这种差异性变小.杨永华及姚建［12］利用BIOLOG微平板研究农药污染对微生物群落的影响，也获得了较好的预期效果.

2 鉴定转基因植物对微生物多样性影响的分子生物学方法

在自然界存在的微生物中，已为人们所认识的仅占很少一部分，能够在实验室培养的种类则更少，至多为1%.其中的原因就在于大多数自然环境中的微生物难于或者不能模拟其生长繁殖的真实条件而无法获得纯培养.20世纪70年代以来，DNA重组技术及基于对RNA序列分析的生物分子系统进化理论的建立，使人们可能在不进行培养的情况下研究微生物.一些分子生物学技术已用于微生物生态的研究，通过从基因水平探索微生物群落的均匀度、丰度、分析菌种的变异情况等，为全面认识微生物多样性在生态系统中的原始构成提供了行之有效的技术手段.

1983年Fisher和Lerman［13］首次将变性梯度凝胶电泳技术（DGGE）引入微生物生态学研究中，变性梯度凝胶电泳了16S r DNA PCR扩增后的片段，确定了环境中微生物群体的遗传多样性，分析了环境中微生物区域的变化.该方法的原理是使用1对特异引物，PCR扩增16S r DNA片段，然后利用DGGE分离产物混合物.由于变性剂浓度以及产物序列的不同，结果不同的产物在凝胶上分离开来.变性梯度凝胶电泳技术不仅能鉴别样品中可培养的微生物的类别，而且还能鉴定不可培养的类别，样品检测速度快，避免了对多个无遗传差别或差别很小的菌株重复进行繁琐的各种表观特征研究，从而大大降低了工作量，结果准确可靠，同时分析得到的谱带，有助于人们高效地进行各种环境样品中微生物的优势菌的分离和优势群落鉴定.

利用PCR-DGGE指纹图谱和主成分分析（PCA）技术，任馨等［14］研究了抗虫水稻Bt基因表达量最高期秸杆和同一时期非转基因亲本水稻秸杆的添加对淹水土壤可培养厌氧细菌数量和细菌群落组成的影响.采用类似的方法，王洪兴等［7］研究了Bt水稻及其亲本秸杆在降解过程中对土壤微生物主要类群的影响.结果发现，与亲本对照相比，Bt水稻秸杆的添加明显地增加了细菌和真菌的数量，而放线菌和反硝化细菌明显降低.

另一种DNA分子水平上的多态性检测是RFLP技术，它是限制性内切酶、核酸电泳、探针-杂交和印迹技术的综合应用.利用PCR-RFLP指纹图谱、克隆文库和测序等方法，段思蒙等［15］比较全面、准确地了解桉树人工林土壤的细菌群落结构，和采用传统培养方法得出的结论不同的是，16S rDNA测序结果表明，桉树人工林土壤细菌在分类方面主要属于Acidobacteria和Proteobacteria，桉树人工林土壤细菌种类丰富，细菌群落结构较复杂.

较为成熟的分子生物学技术还有单链构象多态性分析（SSCP）、16S rDNA文库构建、荧光原位杂交（FISH）、随机扩增多态性（RAPD）等，可以在土壤微生物生态系统研究中应用［16］.或者操作者根据自己的实际情况将上面的几种方法结合检测微生物群落的多样性变化，从而判断和评价转基因植物的环境生态风险性.

Fang等［17］通过DGGE和Biolog分子生物学方法研究了转Bt基因玉米桔秆还田对土壤微生物的影响，结果均表明转Bt基因玉米显著影响土壤微生物群落结构.应用DGGE和T-RFLP分子生物学技术，Liu等［18］通过3年的田间试验，检测了转Bt基因和非转基因水稻根际细菌、真菌群落多样性，水稻生育期显著影响了根际微生物多样性，但是Cry1Ab基因导入对细菌、真菌并无显著性影响.

3 转基因植物中抗性标记基因对微生物的影响及其检测

2004年，Heritage［19］报道，一些肠道微生物在人工培养条件下的生长情况与正常的不同，说明这些微生物可能获得并含有转基因作物的基因，即可能发生了基因转移.抗生素抗性基因已成为转基因植物中常用的标记基因，选择标记基因的安全性应与转化的目标基因一样进行全面评价.Hoffmann等［20］证实转基因油菜、黑芥菜、蒺藜和甜豌豆中抗生素基因可以转移到黑曲霉中.在作物遗传转化操作过程中，大多采用如hpt和npt II基因作为抗生素选择标记基因，用于转基因植株的筛选.

虽然有关抗生素选择标记基因nptII及其表达产物的食品安全性评价已有较多的文献报道［5，21-23］，而对如hpt和npt II基因及其表达产物的环境安全性评价研究，尤其是它们在转基因作物中的表达、根际环境中的残留规律和根系分泌等，至今鲜见报道.Gebhard等［24］研究指出插入转基因甜菜中卡拉霉素抗性基因能够转化Ascinetobactersp.，使这种细菌获得卡拉霉素抗性，从而证明了基因可以在不同物种之间转移的可能性.

4 转基因植物中目的基因的自然遗传转化

遗传转化是指同源或异源的游离DNA分子被自然或人工感受态细胞摄取，并得到表达的水平方向的基因转移过程.DNA是否能发生自然转化，主要取决于环境中是否存在具有转化活性的DNA分子及可吸收DNA的感受态细胞.DNA分子可与固形物（土壤、沙粒子）结合而得到保护，免受DNase的降解，从而能长时间存留于环境中并具有转化活性.同时，自然感受态作为许多细菌应对不利生活条件的一种调节机制，在自然环境中的存在具有普遍性.

重组DNA分子可能发生水平转移的，进入到其他组织或生物体中.Mercer等［25］发现人类唾液中的外源质粒DNA能转化自然活化的StreptococcusgordioniiDL1细菌，由此说明外源基因具有转化微生物的可能性.这样，转基因原料中的外源DNA片断是否会因为自然界的基因重组等遗传过程发生基因逃逸也是转基因植物环境释放时检测中不得不考虑的重要方面.

因此，转基因植物进入生产性实验前检测外源基因在自然条件下能否通过土壤微生物发生转移具有重要意义.基因水平转移现象在原核生物中普遍存在，在真核生物中近年来也发现了众多例证，说明基因水平转移是生物界的普遍现象［26］.植物的落叶、花粉和果实等使土壤中存在大量DNA，并能保留很长时间.外源基因，尤其是抗性基因的水平转移可能改变细菌的基因组DNA，甚至影响该群落的进化方向.

5 微生物在转基因植物产物毒理学检测中的应用

转化的基因可能产生新的代谢产物，这种物质有可能是毒素或过敏原，这样就需要随时将相关工作归入更高或更低的生物安全水平.转基因植物的毒性评价除了常规的通过外源基因编码蛋白的化学组成判断其毒性和采用动物实验或模拟实验的方法评判外源基因编码蛋白的毒性以外，还可以通过更为简单的微生物检测来对转基因植物的毒理安全性进行初步评估.

有毒产品接触微生物后，可造成细胞内蛋白质变性和细胞膜破裂从而导致胞内物质泄漏或遗传物质破坏，从而对微生物造成毒性危害.用适当的指标把这些危害效应反映出来，就能对测试品的毒性程度和浓度大小作出评价.转基因食品的毒理学评价，如免疫毒性、神经毒性、致癌性、繁殖毒性以及是否有过敏源等是安全性评价的重要内容之一［27］.

5.1 遗传毒性实验

Ames等［28］经十余年努力，于1975年建立并不断发展完善的沙门氏菌回复突变实验（亦称Ames实验），是被公认为权威的遗传毒性实验之一.它用于衡量受试品是否具有致突变性，而有研究表明90%的致突变可引起癌症.有的物质是潜在诱变剂，经动物体内肝微粒体酶的转化才能变为诱变剂，因此Ames等［29］人又在原有检测过程中加入大鼠肝脏提取液（S9混合液）以提高检测的准确性.诱变性与物质毒性之间存在明显的相关性，即物质毒性越强，诱变能力就越强.

当前转基因植物毒理安全性评价主要集中在水稻、玉米等粮食作物，薛大伟等［30］通过Ames实验发现，转抗除草剂基因（bar）水稻属实际毒性极微或无毒类物质，被测物对4种突变株没有明显的诱导突变作用.

借鉴于Ames实验原理以及参考转基因食品的检测评价，可以将转基因植物与非转基因植物的各组织的提取液进行Ames实验以初步确定植物表达产物的遗传毒性.艾姆斯实验灵敏度高，可在48 h迅速得出结果，费用较低，仍不失为一种较好的初筛方法，应该成为转基因植物的毒性评价考虑的重要方面.

5.2 细菌发光检测

发光细菌中的FMNH2和醛类在胞内荧光素酶催化作用下，氧化生成FMN、酸和水，释放出肉眼可见的蓝绿色荧光.当环境条件不良或有毒物质存在时，发光能力受到影响而减弱，其减弱程度与毒物的毒性大小和浓度成一定的比例关系.

另外，发光细菌本身没有危害性，所以利用发光细菌的发光强度作为敏感的指标物来监测有毒物质，在国内外越来越受到重视［31］.自美国20世纪70年代首次分离到Photobacteriumphsphoreum细菌并用于污水生物监测获得成功以来，细菌发光检测取得较大发展，成功用于多种类型污染物的监测.欧美国家已经开始利用发光分析来进行食物中金属毒物的快速检测，并已经进行了大量的研究应用，我国于1995年将这一方法列为环境毒性检测的标准方法（GB／T15441—1995）.

转基因产品毒理性的微生物检测还有生长抑制实验，是快速评价化合物对微生物毒理效应中较为常用的另一方法.微生物呼吸代谢检测，细菌生长抑制、呼吸代谢速率或菌落数检测，生态效应检测是另外3大类型的微生物检测.上述各种环境毒物检测方法，都具有一定的局限性，故在实际工作中，通常都采用2种或2种以上的方法，以便进行综合分析和比较.

转基因植物对环境生态安全的影响是一个长期而复杂的过程，且需要个案分析，应该以田间试验为准.目前还没有公认的评估和检测转基因植物生态安全性的方法和标准，本文只是从微生物的变化结果来指导转基因植物目的基因通过微生物水平转移的可能性，从微生物数量和种类的变化来推测转基因植物环境释放的可能性，转基因植物对环境微生物多样性的影响，转基因植物及其表达产物的毒理性等，希望能对转基因植物的环境释放和生态安全评价起到抛砖引玉的作用.对于具体的转基因植物，今后仍需尝试用更精确的方法严格地检测实验转基因植物对生态系统各方面的影响.

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Progress on Influence of Genetically Modified Plant on the Microorganisms in Environment and Their Detection Technology

CHANG Yan-ping1，2，YANG Liang1，LI Chun-qing2，WANG Hua-fang1
（1.College of Biological Science and Biotechnology，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China；2.College of Life Sciences，Hebei University，Baoding 071002，China）

To comprehend the ecological effect of transgenic plant and derived products in the environment，influence of genetically modified plant on the microorganisms in environment and status of their detection technology were generalized.The summary reviewed including conventional methods and molecular methods for examination edaphon diversity，impact of the resistant mark gene in genetically modified plant organisms，and application in microbial toxicology examination of transgenic plants and their derived products.It was also predicted to provide the basis for the development and application，and offer research reference material for the safety assessment of transgenic plants.

transgenic plant；biosafety；toxicological；soil microorganism；detecting technique

Q 938

A

1000-1565（2011）03-0331-06

2010-09-01

国家公益林项目（200704017）；国家“948”项目；国家“863”项目（2004AA244040；2006AA10Z18 2）

昌艳萍（1969-），女，湖北仙桃人，河北大学副教授，北京林业大学在读博士，主要从事生物技术研究.

王华芳（1956-），男，云南石屏人，北京林业大学教授，博士研究生导师，主要从事植物生物技术方面的研究.

E-mail：470978883＠qq.com

赵藏赏）