割手密种质资源研究进展

常 丹,鄢家俊,白史且,梁绪振,干友民,李达旭,游明鸿,杨富裕,张蕴薇

（1.四川农业大学动物科技学院草业科学系,四川 雅安 625014；2.四川省草原科学研究院,四川 成都 611731；3.中国农业大学草地研究所,北京 100094）

割手密（Saccharum spontaneum）即甜根子草,又叫细茎野生种,是禾本科蜀黍族甘蔗属多年生草本植物[1],具有抗逆性强、适应性广、分蘖多等优良特性[2-4]。它不仅是甘蔗属野生种质资源中用于甘蔗杂交育种最早、最有价值的种质[5-6],同时也是甘蔗属中种类最丰富并且具有较高蔗糖含量的野生种[7-10],兼具能源植物和观赏草类开发的潜力植物,本研究从割手密的生态分布、遗传多样性、育种概况等方面对其进行综述。

1 割手密种质资源的植物学特性和生态分布

多年生草本,具发达横走的长根状茎。秆高1～2 m,直径4～ 8 mm；叶片线形,长30～70 cm,宽4～8 mm,无毛,灰白色,边缘呈锯齿状粗糙；圆锥花序长20～40 cm,花序下有白色柔毛；小穗卵形或长圆形[1]。割手密宿根性好,固土力强,能适应干旱沙地生长,是巩固河堤的保土植物[11]。在甘蔗属各个种中,割手密的生态地理分布最为广泛,几乎遍及整个热带和温带地区。它的生态型包括一年生、带有根状茎的多年生[12]。割手密的适应性强,分布范围广,在我国 18°15′～ 33°20′N,97°～ 122°E,海拔1 ～2 460 m的广大地区都有分布[13],主要生长于江、河、湖 、溪 、涧 、沟旁 ,以及河滩沙砾 、沼泽、田埂等多水地带,有较强的耐渍耐涝能力,极少数个体也生长于较干燥的荒坡地上,并出现叶片细窄、中肋发达的抗旱特征,常连片形成单优势群落[14]。

2 割手密种质资源的遗传多样性

2.1 形态学标记及解剖学从形态学或表型性状来检测遗传变异是最直接也是最简便的办法。割手密无性系间显示很宽的形态学变异:有矮而浓密型,叶片几乎只有中肋而没有茎的形成；也有高大、直立、宽叶、长节间型。许多类型都具有高度发达的根状茎,其长达数米,茎多髓甚至中空[12]。潘世明等[15]在福建境内收集了78份割手密无性系进行了性状观察,观察发现福建割手密大概可分为闽西北、闽北和闽东南3种类型。闽西北的割手密植株矮小,茎径细,节间长度较短,单茎质量轻,锤度高；闽东南的割手密无性系正好相反,植株高大,茎径较粗,节间较长,锤度偏低；而闽北的割手密居于闽西北和闽东南之间。杨荣仲等[16]对四川境内59份割手密材料进行聚类分析,分为5类,分别是早熟、高锤度一般表现类型,大茎、较高锤度、高生物产量类型,中茎、偏低锤度、迟抽穗、低生物产量类型,小茎、低锤度较早抽穗、低生物产量类型和小茎、低锤度、低生物产量、不抽穗类型。张革民等[17]对广西和云南共94份割手密材料的主要数量性状进行了主成分分析与聚类分析,主成分分析表明,割手密7个数量性状可简化为3个主成分,即植株因子、茎数因子、糖分因子；聚类分析表明,将94份割手密材料划分为4大类群:第1类群蔗糖分较高,茎多,植株高,萌芽率高；第2类群综合表现一般；第3类群植株高、茎较粗,分蘖少；第4类群蔗糖份偏低,植株较矮,茎较小,萌芽率低而分蘖率较高。张革民等[18]对广西21份高糖割手密无性系的萌芽率、分蘖率、株高、茎径、单茎质量进行了测定,其变异系数均较大,超过10%。其中萌芽率、分蘖率、小区茎数、单茎质量的变异系数分别为48.75%、62.86%、36.21%和56.04%,其极差超过同一性状最小值的3倍以上,表明割手密表型性状变异度较大、变异类型多。齐永文[19]对保育在广东省甘蔗种质资源库中的64份割手密材料进行了9个重要农艺性状的遗传多样性评价,结果表明,64份材料在这9个性状上都表现出了较高的遗传差异,变异系数介于0.17～0.58,均超过10%,再次说明了割手密形态学变异系数较大。用该9个性状对64份材料进行聚类分析,所有试验材料分为3个类群,第1类群的特点是植株生长高大,蔗糖糖分居中,叶子较长、较宽,但是茎数少；第2类的主要特点是糖分、株高都较低,茎数较多；第3类群的特点是大多数性状上都居于第1、2类之间,但是在糖分、蔗汁糖分等指标上高于第1类和第2类。

国外对不同种质材料割手密的形态学评价鲜有报道,个别文献报道的是割手密与甘蔗栽培品种的杂交种的性状扩大利用[20]。Nose等[21]对甘蔗属野生种的叶子气孔交换特性进行了研究,结果表明,高光照强度下,割手密‘Tainan'叶子气孔的二氧化碳交换率明显高于甘蔗杂种‘NCo310'。所以,‘Tainan'是一个有益的甘蔗育种种质来源,同时还阐述了割手密叶子气孔的二氧化碳交换率与叶子的气孔导度、叶绿素含量等紧密相关。

陈严平等[22]对云南大学甘蔗资源圃的割手密的茎进行解剖学制片观察,研究结果表明,割手密的茎均圆形,为髓所充满,成为实心茎；表皮加厚,有2～3层下皮层,下皮层以内无厚壁细胞,由3～6列基本组织的薄壁细胞将外围维管束分开,薄壁区域所占比例大,基本组织较发达。割手密的边缘维管束鞘均呈向心加厚,即靠木质素端有11～18层厚壁细胞,而靠韧皮部端只有2～3层厚壁细胞,且以椭圆方式加厚；与斑茅（Erianthus arundinaceus）圆环加厚的外围维管束鞘及只在韧皮部端加厚的内部维管束鞘等特征有明显区别,这对甘蔗属植物的分类极具参考价值。陈严平等[23]观察了云南省8种甘蔗属及近缘属植物叶片下表皮的解剖结构,观察结果表明,不同重复间,各个种的叶下表皮构造是稳定的,其中割手密叶片下表皮的解剖结构有如下特征:气孔行数为1～2行,但1行的居多,副卫细胞形状为半棱形。下表皮分为2个区:一个为覆盖于维管束上的肋区（或脉区）；另一个为覆盖于两维管束之间的肋间区（或脉间区）。肋区邻接的二侧都有一列刺,割手密的刺细胞呈鹰嘴状,遮盖整个肋区,割手密肋区硅细胞除成1纵行分布外,还见到成2～3纵行分布的情况,且下表皮有附属物乳突。从解剖的角度上进一步证明了割手密成为甘蔗育种中最重要的种质资源的可能性。这些解剖特征可作为外部器官形态分类的补充,也可为甘蔗杂交育种提供解剖学依据。

2.2 细胞学标记细胞学标记能明确显示植物的遗传多态性,染色体数目类型的不同反映了基因资源的遗传多样性。Kuwada[24]最先报道日本的一个割手密无性系为2n=68,此后许多研究者对割手密进行了染色体数的研究。在甘蔗属中,割手密有着最宽幅度的染色体数,从2n=40至2n=128。潘世明等[15]对在福建省境内搜集到的21份割手密无性系进行染色体分析,体细胞染色体数目（2n）变异很大 ,从 72 到 102 不等 ,有 72、80、84、88、92 、96、102共 7种类型,其中 84、88、92、96、102在国内是首次报道,80、96两种类型占多数,各占观察无性系总数的28.57%和23.81%。杨清辉和李富生[25]先后对采自云南省各地的87份割手密及华南地区的75份割手密作了染色体数目的观察研究,结果发现云南割手密染色体数目（2n）有 60、64、70、80,共 4种类型,而华南地区的割手密染色体数目（2n）有54、60、64 、78、80、94、96,共 7 种类型 。蔡青等[26]对国家甘蔗种质资源圃保存的来自9个省区247份割手密的染色体数目（2n）进行了分析,得到 60、64、70、72、76 、78、80、92、96、104、108,共 11 种不同类型 ,其中104和108两种类型为首次报道。

印度Coimbatore甘蔗育种场Panje和Babu[27]对分别采自印度、亚洲西部、东南亚和非洲等地的450份割手密无性系作了染色体计数,其染色体数目（2n）分布为 40～128,共有29种类型。此外,Rithidech和Ramirez[28]、Sreenivasan和Jagathesan[29]对割手密分别进行了细胞学研究。

2.3 蛋白质标记目前,割手密的蛋白质标记主要集中在对其进行同工酶分析。同工酶分析广泛应用于植物的系统进化、群体遗传结构分析、品种鉴定、基因定位、杂种优势等方面的研究。近年来,由于DNA分子标记普及,酶电泳的应用大为减少,但研究水平却在不断提高,至今该方法仍然是快速调查群体水平变异的最有效方法之一。邱崇力等[30]分析云南割手密128份样品的酯酶同工酶,共显示了15条酯酶同工酶酶带,它们组成45个酶谱类型,说明割手密具有非常丰富的种内变异。成萍和陈西凯[31]对四川省的48个割手密材料,采用垂直板状聚丙烯酰胺凝胶电泳进行同工酶分析。在48个材料中,其过氧化物酶谱表现出明显的差异,反映在A、B区酶带数或迁移率的不同。根据同工酶的特征,相应划分为l9个类型,除有6条共有带外,均各有特异带,反映了割手密具有丰富的遗传多样性。陈能武等[10]对采自四川主要流域的割手密脂酶同工酶分析结果表明,四川割手密酶谱类型丰富,多达18种,说明四川割手密存在多样性,且类型丰富。特别是随着采集流域由西向东分布,在各流域材料的酶谱中,具同工酶慢带或较慢带（1-4A）的材料比例由高到低逐渐降低,这可能预示着割手密的进化传播呈一定的规律。王子琳等[32]对49份福建割手密的酯酶同工酶进行测定,结果共呈现8条酶带,从正极到负极依次为2-14A,有19种酶谱类型,表明福建割手密有较丰富的种内变异。潘世明等[15]用聚丙烯酰胺双垂直平板电泳法分析了50份福建各地的割手密无性系,结果共呈现8条酰酶同工酶酶带,19个酶谱类型。

国外关于割手密蛋白质标记方面的研究报道较少,仅见Sucheela Siriwasaree[33]对几个割手密无性系（2n=64,72,80,88）进行了过氧化物酶同工酶分析,结果表明,各无性系酶带各不相同,过氧化物酶同工酶系统可以用来作为割手密无性系的识别指南。

2.4DNA分子标记分子标记是传统遗传标记的补充与发展,许多以前无法进行的研究目前利用分子标记手段正蓬勃开展。形态标记、细胞学标记和生化标记的所反映的遗传多态性的分子基础均是基因组DNA的变异,而DNA分子标记所揭示的遗传多态性最直接反映基因组DNA间的差异。国内基于分子标记对割手密不同种质材料遗传多样性的报道很少,而且采用的分子标记技术也很单一。杨清辉等[34]选用6个随机引物,对采自我国不同纬度、不同海拨高度的 32份割手密无性系进行了RAPD分析,结果表明,割手密野生种具有丰富的RAPD多态性,供试的32分割手密无性系可划分为9个类群。张革民等[19]利用27个引物对21份割手密无性系的基因组DNA分别进行RAPD扩增,27个引物共检测出205个RAPD位点,其中多态性位点159个,多态性位点百分率为74.84%,21份割手密无性系间的等位基因位点的异质性程度较高,表现出较丰富的遗传多样性。

国外,Silva等[35]绘制了割手密RFLP连锁图并对其染色体组进行了分析,RFLP连锁图由16个DNA探针检测到的216个基因位点构成,分布了44个连锁群,按照每隔25 cmol的间距至少一个标记的密度,基因组的覆盖率被估计为 86%,基于RFLP分子标记的检测数据得出结论,该物种是一个同源多倍体,估计其基因组大小为2 107 cmol。Cordeiro等[36]利用SSR分子标记技术对甘蔗属植物进行遗传多样性分析和聚类分析,6对SSR引物分析了66份不同的材料,产生了187个等位基因,与其他分子标记技术RFLP、RAPD以及AFLP相比,SSR分子标记技术更适合研究甘蔗种属间的起源与分类。

3 割手密种质资源的抗逆性

3.1 抗寒性我国曾进行过几次较大规模的甘蔗野生种质资源的搜集,但对野生种质资源的抗寒性鉴定、分析、评价,目前做得尚少。丁灿等[37]研究了来自不同原生地割手密无性系叶片中的游离脯氨酸（Fpro）的含量与低温的关系,结果表明,冬季割手密叶片中Fpro的含量与其原生长地的海拔、纬度之间呈极显著的正相关关系,冬季的Fpro含量平均值分别是夏季的11.4和7.7倍,导致Fpro积累的真正原因是低温。叶片中Fpro含量与其抗寒性关系十分密切的特点,表明它可以作为甘蔗近缘野生种抗寒力鉴定的指标。陈能武等[10]对四川省制糖糖料工业研究所保育的割手密进行了抗寒性和抗旱性鉴定,其中,抗寒性的鉴定结果表明,抗寒性强的材料其成活率可达100%,而抗寒性弱的材料植株侧芽完全死亡。全部参试材料的抗寒性呈正态分布,而川88-33,79-l-4,内江44和川79-1-23等材料在几种鉴定方法中则表现出稳定的抗寒能力,它们的萌芽率高,冻后生长正常,是今后开展甘蔗抗寒育种时可利用的宝贵资源。

3.2 抗旱性陈能武等[10]采用田间自然鉴定的方法对割手密进行抗旱性鉴定,在参试材料中,有6份材料经过干旱处理后植株生长正常,且无明显的枯、黄叶出现,呈现出较强的抗性。其中最突出的材料是川79-1-15,79-1-17,79-1-21,79-2-20。这些材料一般都是在旱坡、悬崖等地采得,在长期的自然进化过程中对缺水、干旱产生了较强的适应性,在人工栽培和水份控制下其抗性和适应性得以充分发挥。那些抗旱性表现弱的材料植株生长受到抑制,在水分控制条件下生长完全停止,个别植株甚至死亡。许文花和杨清辉[38]以云南农业大学野生甘蔗资源圃内采集到几个不同无性系的割手密为参试材料,研究水分胁迫对割手密伸长期的抗旱性影响。测定苗期植株的叶面积,质膜透性、含水量、束缚水含量、失水速率等多个指标,结果表明,不同无性系间各指标的耐旱系数不同,利用模糊隶属函数对割手密抗旱性进行评价表明割手密不同无性系间的抗旱性不同。相关分析表明,割手密不同无性系间的抗旱性与植株叶面积呈显著负相关。

4 割手密在甘蔗育种中的应用

割手密是甘蔗野生种质中用于甘蔗杂交育种最早、利用最有成效的种质[6-7],具有抗逆性强、适应性广、多蘖等许多优良特性[2-5]。广西甘蔗研究所采用甘蔗花粉贮藏技术后,种属间杂交工作始步入正轨,杂交组合主要是以广西割手密和云南割手密的组合为主,主要目的是引入本地割手密适应性好、抗性好以及云南割手密的大茎、生势好的基因。此外,割手密的低温贮藏性能较好,杂交成功率高,也是该种杂交组合较多的原因之一[39]。我国海南甘蔗育种场,通过种属间杂交,也获得一批割手密优良后代,在育种上起到了重要的作用[40]。20世纪初的“甘蔗高贵化育种”就是因为甘蔗属热带种不抗萎缩病,通过与爪哇割手密杂交和回交开展起来的。美国农业部路州荷马甘蔗试验站60年代以来开展的基础杂交育种计划,已将耐寒性强的割手密野生种耐寒特性基因导入亲本材料,选育出CP65-357等大批早熟高糖耐寒性强的品种,不仅在美国路州种植,我国引进后,近年来在湖南、江西表现优异,试种成功[41]。此外,Tai[42]研究了用低温冷藏法保存商业化品种甘蔗和野生割手密杂交一代的花粉。

5 作为能源植物研究概况

禾本科能源作物是当今两大类最有前途的生物质能作物之一[43-46]。割手密不仅植株高大,生物产量高,有较高的光合效率和干物质积累能力,因此,按照能源作物应具备的特征[47],割手密具有较高的生物质能转化潜力。目前已经开展了对割手密作为能源草开发利用为目的的种质资源考察收集工作[48]。王水琦等[43]已从优良的甘蔗栽培品种与特殊优异的割手密远缘杂交后代中,选出较好的8个品系作为能源蔗进行研究,对高生物量的能源蔗加以开发利用。在光合特性方面,杨生超等[49]已对割手密的光合特性与原生长地的海拔关系进行了研究,研究表明,割手密无性系在光合特性方面随着原生长地海拔的不同存在丰富的多样性特征,其光合特性与海拔密切相关。在国外,印度Anuj和Chandel[50]已将割手密作为能源植物用以生产乙醇,通过实验测得割手密含有（45.10±0.35）%的纤维素和（22.75±0.28）%的半纤维素,并认为割手密生长速度快,经济投入少,是生产乙醇的理想能源植物。

6 前景与展望

割手密不仅具备能源植物应有的特征,而且其根系非常的发达,可以用来固土护坡,防止水土流失,同时也是一种观赏性比较强的禾草,具有重要的经济价值和生态价值,应更广范围的收集野生割手密资源,建立全国性的割手密种质资源圃,在弄清其遗传规律的基础上加快开发利用。

目前,我国对野生割手密种质材料或居群的遗传多样性的报道大多体现在同工酶方面,利用分子标记对其遗传多样性的报道还很少,应当加快利用多种分子标记技术评价其遗传多样性的步伐。割手密育种手段比较单一,普遍采用的是有性杂交育种,但这个过程受其开花和自然条件、人为选择多因素制约,周期长,效率不高,应结合物理、化学诱变育种以及生物技术育种等多种育种方式培育出符合经济建设和生产需要的优良品种。国内外对割手密的研究主要集中在利用其优异基因对栽培甘蔗的遗传改良上,对其以生物质能源研究为目的的报道尚少。从能源和环保的角度出发,割手密是具有巨大潜力的绿色能源植物。为此,应充分利用分布范围较广的野生割手密资源,利用其遗传多样性和杂种优势筛选出具有高生物产量、高酒精产率的割手密新品系,进一步拓展能源研究新途径。

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