草地硝化微生物与硝化作用研究进展

刘天增，南志标

(兰州大学草地农业科技学院 农业部草地农业生态系统学重点实验室，甘肃 兰州 730020)

草地是地球上最为宝贵的自然资源和陆地生态系统的重要组分，不仅承担着防风固沙、保持水土、涵养水源、调节气候、维护生物多样性等重要生态功能，而且也是重要的畜牧业生产基地，其功能的正常发挥对维持全球及区域性生态系统平衡有极其重要的作用。氮素作为植物必需的大量元素是限制草地生产力的主要因素之一，植物能直接吸收利用的土壤氮素主要是铵态氮和硝态氮，经常会因缺氮而使生长受到限制，进而降低草地生产力[1-2]。草地生态系统中，植物从土壤中吸收无机氮合成有机氮，部分被动物摄入转变成动物产品，剩余部分通过粪便与尿液归还土壤。没被动物采食的植物变成凋落物，这些凋落物中的有机氮通过微生物矿化和硝化作用转变为无机氮，参与氮循环过程。硝化作用是氮循环中的一个重要环节，对生态系统的氮平衡起决定性作用[3]。在温度、pH值等环境条件适宜情况下，土壤中的硝化作用会迅速发生，而硝化作用产生的硝酸盐淋失和N2O排放都会导致草地系统氮损失[4-5]。随着人类对草地资源利用程度的不断增加，土壤中的硝化作用会向大气中释放更多N2O，从而导致全球气候不断变暖[6]。近年来，过度放牧、草地农垦等已严重破坏草地氮循环过程[7]。因此，研究草地硝化微生物与硝化作用对提高草地生产力，促进草地合理开发与利用，改善草地生态环境等有十分重要的意义。本研究对近年来国内外草地硝化微生物及硝化作用研究成果进行回顾和总结。为今后合理开发和持续利用草地资源提供参考依据。

1 硝化作用

1.1硝化作用 硝化作用(nitrification)是指由硝化微生物将NH3氧化成NO2-，再氧化成NO3-的过程，是氮素生物地球化学循环中重要的一个环节。自然环境如水体和土壤中，硝化作用是一个主要由微生物介导的反应。陆地生态系统中，硝化作用一方面影响氮素对植物的供给；另一方面，由于硝态氮带有负电荷，不易被土壤胶体吸附，易因淋溶而损失污染地下水，从而造成氮素损失[3]。

1.2硝化作用类型

1.2.1自养硝化作用 自养硝化作用分两步进行，先由氨转化为亚硝酸，然后由亚硝酸转化为硝酸，这两个过程分别由氨氧化细菌(ammonia oxidizing bacteria，AOB)和亚硝酸氧化细菌(nitrite oxidizing bacteria，NOB)完成。已知所有土壤中的AOB都属变形菌纲(Proteobacteria) β亚纲，β-Proteobacteria亚纲的AOB可分两个类群：即亚硝化单胞菌群(Nitrosomonas)和亚硝化螺菌群(Nitrosospira)两个属[8]。γ-Proteobacteria亚纲主要是亚硝化球菌属(Nitrosococci)，适合在海洋环境中生长[9]。NOB主要包括硝化杆菌属(Nitrobacter)、硝化球菌属(Nitrococcus)、硝化刺菌属(Nitrospina)和硝化螺菌属(Nitrospira)[10-11]。迄今为止，土壤中只检测到硝化杆菌属，其他NOB属在自然界的分布还不清楚。但由于氨氧化过程是硝化作用的限速步骤，氨单加氧酶(ammonia-monooxygenase,AMO)是氨氧化过程中的主要酶类，它催化氨转变为羟胺，羟胺又由羟胺氧化酶(hydroxylamine oxidoreductase, HAO)催化生成亚硝酸[12]。因此，近年来AOB的研究报道远多于NOB。

1.2.2异养硝化作用 异养硝化作用是指异养微生物在好氧条件下将还原态N(包括有机氮) 氧化为NO2-和NO3-的过程，在自然界的硝化过程中起着重要作用。异养硝化菌种类繁多，除自养硝化细菌外，真菌被认为是数量最大、效率最高的异养硝化菌。此外，某些细菌和放线菌也被确定为具硝化能力的异养微生物[13]。

通常，异养硝化微生物通过两种代谢途径进行硝化作用。1)某些已知异养硝化细菌如脱氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)、球硫小菌属(Thiosphaerapantotropha)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)和粪产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis)等，与自养硝化菌有相似的氧化酶系统，先由氨单加氧酶催化氨氧化得到羟胺，然后由羟胺氧化酶催化得到亚硝酸氮[14]。所以，当代谢基质过剩时，这些异养微生物就有了生长优势，保持较高的生长速率而抑制其他微生物的生长[15]。2)真菌硝化作用。Wood[16]发现，当过氧化氢和超氧化物同时存在时会生成羟基，而含氮化合物会与羟基发生反应；当氧化酶和过氧化物酶释放到环境中时，细胞溶解和木质素降解过程中会给羟基的形成提供条件。异养硝化作用经常用来说明自养硝化微生物不能生长或未能检测到土壤中实际发生的硝化作用，但对于异养硝化的机理及生理学意义还不清楚。

自养和异养硝化作用常用的区别方法是采用选择性抑制剂。自Hynes和Knowles[17]提出乙炔可用于硝化抑制剂后，乙炔已成为最常用的自养硝化特效抑制剂，能被氨单加氧酶氧化成具有较高活性的物质，从而引起该酶不可逆的抑制作用。

2 硝化作用微生物

氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea, AOA)是一个独立于AOB进化枝之外的进化类群，是自然界中最丰富的氨氧化微生物，其功能与AOB类似，可将NH4+氧化成NO2-。在AOA发现之前，通常认为AOB是硝化作用的主要执行者，随着硝化作用的深入研究，AOA在氮循环过程中的重要作用被逐渐发现和认识。研究表明，氨氧化作用并非只由AOB类群完成。第1株AOA-Nitrasopumilus maritimus的成功培养有力证明了AOA在自然界中的存在[18]。AOA的发现迅速成为环境微生物生态学功能类群方面的研究热点之一。国际上主要针对AOA的生态分布、丰度以及生态功能等开展系列研究。16S rRNA和DGGE分析表明，在酸性和中性土壤中AOA的种群结构完全不同，基因拷贝数及mRNA转录的多样性与一系列pH梯度形成对照，AOA的amoA基因和转录多样性随着土壤pH值的升高而降低[19]。目前，很少有文献报道草地AOA的多样性以及AOA在氮循环中的作用。

AOB将氨转化为硝酸盐作为唯一的能源而进行氨氧作用，所有的AOB都含有编码催化氨氧化第1步反应的氨单加氧酶基因amoA, amoA基因在氨氧化菌中普遍存在且可作为氨氧化菌特异的分子标记。AOB是严格的好氧型微生物，并广泛分布于几乎所有土壤中，其活性受土壤含水量的影响，过高或过低的土壤含水量都不利于硝化微生物活动。张树兰[20]研究表明，在土壤田间持水量达到60%时土壤硝化作用最为强烈，在土壤田间持水量达到40%和80%时土壤硝化作用都受到不同程度的抑制。AOB种群结构也受到土壤水分的调节，在半干旱地区不同的土壤水势条件下，AOB种群结构差异显著，而且在-100 kPa的水势下土壤硝化势最高[21]。同样在稀树草原上，AOB数量和硝化作用均是雨季最高，干旱季最低[22]。16S rRNA分析表明，在天然草地中AOB种群中的亚硝化螺菌3a和3b决定了硝化作用的滞后性。在亚硝化螺菌3a占优的天然草地土壤中出现了硝化作用的滞后现象，而在以亚硝化螺菌3b和亚硝化单胞菌为主的土壤中没有观察到硝化作用的滞后现象[23]。

AOA和AOB在土壤中共同存在，但它们的分布又取决于环境条件。在土壤中AOA占据多数，但在某些条件下又以AOB为主，硝化作用的差异主要与种群大小有关。有结果表明，在硝化作用过程中AOA的作用大于AOB，与AOA相比，AOB的种群变化较小[24]。Leininger等[25]研究认为，大多数土壤中AOA数量和活性上都要高于AOB，而且比AOB更能适应多种环境。土壤pH值对AOA有选择性，在酸性土壤的硝化作用过程中，AOA和AOB具有完全不同的生理特性和生态作用[19]。有研究认为，草地土壤中AOA的数量与AOB相似[26-27]。Roux等[27]用古菌amoA的特异引物对法国Theix地区半天然放牧草地土壤进行了研究，试验结果表明，放牧地的AOA丰富度显著高于不放牧，并且与AOB的丰富度近似，休牧降低了AOA的丰富度，硝化活性与AOB和AOA的丰富度呈正相关。也有研究认为硝化作用与AOB丰富度相关[28]，而且认为在NH4+转化为NO3-的过程中，AOB比AOA起更主要的作用[29]。所以，目前认为AOB在草地硝化作用中起主要作用，AOA还需要进一步研究。

3 影响草地硝化作用的因素

3.1家畜排泄物 氮是草原生态系统循环中的重要化学元素，放牧家畜通过土壤植物动物系统对草原土壤氮养分施加着显著的影响。研究表明，放牧家畜对采食植物中的氮只消化吸收一部分，其中60%～90%的养分又以粪尿形式归还草地[30]；当粪尿沉积草地后，粪尿中的氮通过微生物作用被转化为可利用氮素形式。因此，家畜排泄物的返还通过加速草地氮循环，对参与氮素循环的微生物类群产生影响[31-32]。可见，粪尿沉积是放牧草地生态系统中硝化细菌种群结构发生变化的主要原因[33-34]。

畜尿沉积影响AOB的空间分布和种群结构及硝化酶活性[35]。当畜尿进入草地后尿素很快转化为铵，使得土壤中NH4+浓度和pH值升高[36]，从而导致AOB菌种群结构改变。Mahmood和Prosser[37]在天然草地上施加不同浓度人工合成羊尿后发现，低浓度羊尿处理下AOB以亚硝化螺菌 cluster 4为主，中浓度和高浓度羊尿处理下以亚硝化螺菌 cluster 3为主，而亚硝化螺菌 cluster 2在低、中、高浓度羊尿处理中都存在；Patra等[38]和Webster等[23]也发现，由于天然、半天然和放牧草地重度放牧区表层土层NH4+-N含量显著高于轻度放牧区，而不同浓度的NH4+导致不同放牧强度的AOB种群结构和硝化活性差异，且硝化活性变化前AOB种群结构已发生改变。同时，Roux等[39]通过对法国Theix地区已放牧35年的半天然草地进行研究，发现重牧下硝化酶活性比轻牧高；放牧导致AOB种群结构发生变化，使其硝化活性与丰富度增加，休牧降低其活性与丰富度。可见，不同NH4+浓度的选择作用是AOB种群结构变化的主要原因，较高的NH4+-N能提高土壤硝化活性，从而给硝化细菌的生长提供了更有利的条件[40-41]。

3.2植物 植物是土壤微生物赖以生存的有机营养物质和重要能量来源，是影响土壤微生物群落的重要因素之一，其类型、群落组成等是土壤微生物区系变化的主要驱动力量[42]。Malchair等[43]研究种植豆科、禾本科和杂草植物对土壤AOB功能和多样性的影响，PCR-DGGE结果表明豆科植物在种植16个月后，土壤AOB条带数减少但硝化势却增加，AOB数目与硝化势呈负相关关系。豆科植物土壤中AOB种群结构也与其他处理不同，主要差异在于亚硝化螺菌cluster 3。在种植禾草和杂草的土壤中没有检测到cluster 3b，在种植豆科植物的土壤中没有检测到cluster 3a。Webster等[23]研究发现亚硝化螺菌cluster 3又可分为两个类群cluster 3a和cluster 3b。cluster 3a对于高浓度氨较为敏感，而cluster 3b和亚硝化单胞菌对高浓度氨不敏感。Habekost等[44]发现，与不种植豆科植物的土壤相比，种植豆科植物的土壤中微生物种群组成不同，含有更多的革兰氏阴性细菌。

地上植物多样性可引起地下根系分泌物和凋落物质量的多样性，进而影响土壤微生物的活性[45]。不同放牧强度下半天然放牧草地3种主要植物绒毛草(Holcuslanatus)、燕麦草(Arrhenatherumelatius)和鸭茅(Dactylisglomerata)之间土壤NH4+-N含量无显著差异。放牧和植物类型共同影响AOB的种群结构，在燕麦和鸭茅土壤中放牧对AOB有显著影响，但在绒毛草土壤中无显著影响。不同植物类型对AOB有显著影响，然而与放牧相比，植物的影响要弱于放牧[39]。Rutigliano等[46]研究了地中海地区高灌木、矮灌木和草地植被类型下土壤的硝化作用后发现，草地的硝化作用高于高灌木和矮灌木，而且水分是限制硝化作用的重要因素。在内蒙古半干旱地区冬季植物停止生长的时期，草地的硝化作用高于灌木和森林，在冬季硝化作用是氮素转化的主要形式，形成的矿质氮在第2年春天又可以被植物吸收，但如果降水过多，会导致更多的氮素损失[47]。Smits等[48]研究了斜坡植被梯度对草地硝化作用的影响，结果发现，与坡顶和坡底相比，中间植被区域的NH4+/NO3-最高，且硝化作用受到明显抑制。然而，硝化速率的差异与AOB的种群结构无关。

铵的有效性是解释上述结果的主要原因，豆科植物可以通过生物固氮来增加土壤中的氮。增加铵有效性来影响硝化作用主要有两个途径：一是增加硝化微生物的种群数量和改变种群结构。一般认为铵是硝化作用的限制因素，所以增加AOB的种群数量会增强硝化作用。二是高浓度铵会影响AOB的种群组成，使AOB尽可能的适应周围的土壤环境。尽管所有AOB的代谢都基本相似，但不同的种对NH3的亲合力不同[49]，例如，亚硝化螺菌属中的一些种类对氨浓度为6～11 μmol/L内都有亲合力[50]。这一机理淘汰了硝化效率低的菌种，从而解释了AOB丰富度降低而硝化作用却增加的现象。

3.3火烧 在干旱或半干旱环境下，火烧作为一种重要的自然干扰方式会引起草地生态系统短期或长期的变化[51-52]。火烧对草地硝化作用的影响不同学者有不同的观点。在高草草原，适宜的火烧对植物的生长是有利的，火烧有助于提高土壤微生物的活性[53]。李玉中等[54]采用同位素15N库稀释技术结合扰动较小的管型取样法，测定了羊草(Leymuschinensis)草地火烧与未火烧区不同季节土壤氮的硝化速率，结果表明，火烧地的硝化速率在草地返青后的4、5月高于未烧地，到生长季末的9月又高于未烧地。草地火烧后地表变黑，去除了地上植物和凋落物的遮荫作用，这样就减少了火烧地对太阳能的反射，使火烧地能够吸收较多的太阳能,增加土壤温度，而温度的升高又利于土壤中氮素转化细菌的活动[55]。火烧后可使草地土壤pH值升高，在一定范围内有助于硝化细菌的生长。草地火烧后大量的营养元素以无机态的形式从地上凋落物中释放出来，在某种程度上相当于施肥的作用，从而促进了硝化作用。然而，Zhou等[56]研究表明，火烧显著降低了内蒙古典型草原土壤的硝化作用；笔者认为火烧并未影响土壤中无机氮的含量，但与未烧地相比火烧地减少了地上凋落物和土壤含水量，抑制了硝化作用。

3.4土壤pH值 在20世纪初，由于检测到酸性土壤中NO3-浓度很低，只有加入石灰或采用其他提高pH值方法的土壤中才会有的NO3-积累，所以，一般认为在酸性土壤中(pH值<5)不存在NH4+转化为NO3-的硝化作用过程。然而随着有关酸性土壤中有硝态氮积累的报道的增多，发现酸性土壤中存在微生物的硝化活性[57-58]。到20世纪后期，普遍认为在很多的酸性土壤中都能发生硝化作用。酸性土壤中硝化作用的许多报道及其对环境的负面影响，推动了对这些微生物及相关机理的研究。大部分的研究集中在化能无机营养型(自养硝化作用)和化能有机营养型(异养硝化作用)的相关报道。

至今，有关酸性土壤硝化作用产生的机理得到了较深入的研究，主要有两种解释：1)硝化细菌为酸敏感菌株，其硝化作用仅产生于pH值呈中性的微小区域中，可能是由于施肥或其他措施使局部区域pH值上升导致硝化作用[59-60]。2)硝化细菌在细胞周围形成一粘液层，从而能适应酸性环境[61]。Islam等[62]利用15N标记技术在室内测定了澳大利亚两种有机质含量较高的酸性草地土壤中的异养硝化作用，发现异养硝化作用分别占到总硝化作用的7%和19%。异养硝化细菌利用有机氮化合物而不是NH4+作为硝化作用的底物。

4 硝化作用与N2O排放

N2O是重要温室气体，是氨氧化过程中的一种副产物，硝化和反硝化作用是土壤中N2O生成的两个最主要过程。草地系统中，放牧家畜粪尿沉积增加N2O的排放量。Williams等[63]用15N标记人工羊尿施加草地后发现，畜尿沉积后24 h内，N2O的排放量约占整个草地的8%；24 h后，N2O排放从3.9增加到42.3 μg/(m2·h)，且硝化和反硝化作用对N2O的贡献相等。

土壤环境的不均衡性，使硝化和反硝化作用同时发生。这主要与土壤持水量有很大关系，45%的土壤持水量既提供了有氧环境又提供了厌氧环境，使硝化作用和反硝化作用同时发生[64]。利用AIM乙炔抑制法测试了内蒙古放牧和非放牧羊草草原土壤N2O产生的微生物过程，结果表明，在春季植物返青时，羊草草原非放牧土壤自养硝化作用较强，反硝化作用仅产生少量的N2O；放牧土壤N2O的产生过程中以异养硝化作用为主，反硝化作用也产生少量的N2O。在夏季和秋季的土壤N2O的产生过程中仍以异养硝化作用为主，放牧草原反硝化作用对N2O的产生却没起作用。冬季放牧草原仍是硝化作用过程产生N2O，其中自养和异养硝化菌的贡献基本相同，反硝化作用却无贡献。由于牲畜粪尿的排泄，放牧草原较非放牧草原土壤有较多的外加有机碳、氮源，有助于土壤微生物的活性，促进了土壤硝化作用和N2O的产生速率[5]。过度放牧地硝化速率始终高于保护区，主要原因是放牧地由于放牧不当致使其严重退化，牧草生长矮小，对土壤中矿化的铵态氮和硝态氮吸收减少，从而使得NH4+有一定的积累，因而土壤硝化作用强度较高，产生的硝态氮由于植物利用较少，使得硝态氮有一定的积累[65]。Zaman等[66]在新西兰放牧草地添加尿酶抑制剂(Agrotain)和硝化作用抑制剂(DCD)后发现，Agrotain减少NH3排放，对N2O无影响；DCD减少了N2O排放但却增加了NH3排放；两者混合使用后同时减少了NH3和N2O的排放，而且增加了牧草产量及植物对氮素的吸收。

5 研究展望

在草原土壤中，硝化微生物与土壤中氮素的转化及其利用有直接关系，与生态因子的改变密切相关。研究草地硝化微生物有助于草地生态系统中氮素的损失和管理，为草原管理提供深层次的理论依据。从目前的研究现状来看，虽然还无法通过传统微生物学的方法对其进行研究，但是分子生态学方法的引入给该领域的研究带来了新的契机。根据现有的硝化微生物生态学知识对传统的微生物学方法进行改进，结合现代分子生态学方法筛选出对环境适应能力强的特殊硝化微生物，特别是对高浓度氨不敏感的微生物种群将是该领域研究的重点。此外，随着研究的深入，与硝化作用有关的一系列科学问题有待研究者进一步探讨。例如：硝化微生物种群结构和硝化活性的变化能否解释实际土壤硝化作用的变化？在放牧草地中，当放牧强度改变后土壤中硝化微生物的数量或种群结构的变化是由植物群落引起的还是由家畜排泄物及践踏作用引起的？硝化细菌和古菌在土壤N2O排放过程中谁的贡献较大？这些问题都缺乏系统地研究，至今还没有一致的结论。目前对硝化微生物的研究已经涉及到诸多方面，然而在探索此类微生物功能代谢与生态分布的同时，如何利用这一类特殊的微生物资源为生态环境服务、对环境变化进行预警仍然有待于科研工作者不懈的努力。

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