重组Runx3腺病毒联合顺铂对小鼠肝癌移植瘤生长抑制作用研究

张 静,任松森,许光华,张海元 (长江大学医学院,湖北荆州434023)

肝细胞癌 (hepatocellular carcinoma,HCC)是人类常见的消化道恶性肿瘤,其发生发展同其它恶性肿瘤一样存在细胞周期调控基因的改变。在利用顺铂 (cisplatin,DDP)等化疗药物治疗过程中,因化疗药物毒副作用较大并经常产生耐药性,影响化疗效果。近年来人们从改变细胞周期着手抑制肿瘤细胞生长开展了多种研究[1-3],实验证明p21、FUS1等抑癌基因能明显增强肿瘤细胞对顺铂等化疗药物的敏感性。重组腺病毒介导的基因治疗最为广泛且安全可行,本研究拟采用低剂量的顺铂和重组Runx3腺病毒联合应用于小鼠的人肿瘤模型,以探讨其在动物体内是否具有协同作用,从而在今后临床治疗中,通过联合用药减少肝癌患者顺铂的使用剂量,降低顺铂对患者的毒副作用及耐药性。通过本项目的实施,有望获得全新的抗肝细胞癌生物治疗方案。

1 材料与方法

1.1 材料

H22肝癌细胞株由新加坡国立大学肿瘤研究所馈赠,小鼠腹水传代。6～8周龄健康小鼠40只,雌雄各半,体质量18～22g。DDP购于锦州九泰药业公司,空腺病毒Ad(GFP+)由四川大学馈赠,Ad-Runx3由本课题组构建。

1.2 方法

1.2.1 荷瘤小鼠模型的建立 无菌操作,取H22小鼠腹水,台盼蓝染色,光镜下瘤细胞计数,活瘤细胞＞90%,调整细胞浓度为5×106个/ml,分别取0.2ml于右腋皮下注射,制成实体型荷瘤鼠模型,2周后于小鼠右腋皮下形成H22肝癌细胞系移植瘤。

1.2.2 实验分组与治疗 20只荷瘤小鼠随机分成4组,即对照组 (生理盐水0.2ml)、Ad-Runx3组(3×1010pfu/ml)、DDP组 (10mg/kg)、联合治疗组 (Ad-Runx3+DDP组),每组5只。其中Ad-Runx3实施瘤体内注射,而生理盐水或DDP分别进行腹腔内注射,每周2次,共2周。在最后一次注射治疗结束后第2周,用颈椎脱臼法处死荷瘤小鼠,观察各项指标。

1.2.3 称取瘤重并计算肿瘤抑制率 小鼠处死后分别取出肿瘤瘤体,剥离干净后用滤纸擦拭干净,电子天平称取瘤质量,并按公式计算抑瘤率。抑瘤率 (%)=(1-实验组瘤质量/对照组瘤质量)×100%。

1.2.4 肿瘤组织细胞超微结构的电镜观察 切取上述各组小鼠肿瘤组织,分别经40g/L戊二醛及10g/L四氧化锇预固定和固定后,用乙醇及丙酮逐级脱水,环氧树脂包埋,制作0.5μ m厚薄切片,醋酸双氧铀及枸橼酸铅染色,利用透射电镜观察。

1.3 统计学分析

应用SPSS13.0软件进行数据处理,采用方差分析检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 顺铂联合Ad-Runx3对肝癌移植瘤的抑制作用

联合治疗组 (Ad-Runx3+DDP)小鼠肿瘤生长明显受到抑制,移植瘤质量为 (0.97±0.19)g,抑瘤率为65.7%;DDP组移植瘤质量为 (1.56±0.17)g,抑瘤率为45.3%;Ad-Runx3组移植瘤质量为(1.72±0.21)g,抑瘤率为42.6%;对照组移植瘤质量为 (2.65±0.26)g。治疗组与对照组比较具有统计学差异 (均P＜0.05),联合治疗组 (Ad-Runx3+DDP)与Ad-Runx3组或DDP组比较差异具有统计学意义 (均P ＜0.05)。

2.2 H22移植瘤超微结构的变化

透射电镜观察结果显示,对照组大部分细胞结构完整,常染色质丰富;顺铂治疗组可见细胞大量坏死,未见明显细胞凋亡指征;Ad-Runx3治疗组可见部分早期凋亡细胞;Ad-Runx3+顺铂联合治疗组可见明显的凋亡小体结构,细胞质密度增高,染色质高度凝集固缩。

3 讨 论

Runx3基因 (runt-related transcription factor gene)是近年来发现的一种新型抑癌基因,与人类多种肿瘤的发生、发展有着极其密切的关系,受到国内外学者的广泛关注。Runx3基因在消化道上皮细胞生长调控中起着重要作用,能抵抗TGF-β诱导的生长抑制和细胞凋亡,调控消化道上皮细胞分化,Runx3基因的不正常表达与胃癌、结肠癌、胆道肿瘤等消化道恶性肿瘤发生密切相关。据Song等[4]报道,原发性肝癌也存在着严重的TGF-β信号转导障碍,这说明Runx3基因可能在肝细胞肝癌 (HCC)的发生发展过程中是关键性的肿瘤抑制基因,其功能失活可导致TGF-β/SMADS信号通路削弱。顺铂是临床应用最为广泛的一种抗癌药物,近年来,应用顺铂治疗消化道恶性肿瘤取得了长足进展。有研究表明,顺铂类化疗药物治疗肿瘤的机制之一是通过P53依赖途径而诱导细胞凋亡来实现对肿瘤细胞的杀伤[5]。顺铂类化疗药物可使肿瘤细胞的DNA受损伤,损伤的DNA启动p53基因,使细胞进入G1期生长抑制,并诱导损伤严重的细胞进入凋亡状态。顺铂副作用较大,顺铂用量增大容易引起骨髓抑制及肾功能严重损害,另外顺铂使用剂量趋近于亚致死剂量时易引起耐药性。临床上采用了多种联合化疗方案,大部分具有减毒增效作用。

腺病毒是肿瘤基因治疗最具应用前景的载体之一[6],腺病毒载体感染肿瘤细胞时,不依赖细胞周期,表达水平高,且不会发生随机整合,安全性好。本研究以复制缺陷型腺病毒为载体,构建重组Runx3腺病毒 (Ad-Runx3)。通过在小鼠体内移植肝细胞癌,并分别采用化疗药物顺铂、Ad-Runx3及联合用药 (DDP+Ad-Runx3)等方法进行治疗,结果显示,联合治疗组小鼠肿瘤生长明显受到抑制,移植瘤质量为 (0.97±0.19)g,抑瘤率达到65.7%,与顺铂治疗组和Ad-Runx3治疗组比较差异具有统计学意义,本实验结果说明化疗药物顺铂和Ad-Runx3联合应用在抑制干细胞癌瘤体生长和增加抑瘤率中都发挥明显疗效,显著抑制干细胞癌的增殖生长,起到明显的协同效应。在使用投射电镜观察移植瘤超微结构来看,联合治疗组可见凋亡小体,细胞质密度增高,染色质高度凝集固缩,相较于单独使用顺铂组或Ad-Runx3组而言,凋亡特征非常明显。

通过本实验的研究,我们认为联合应用Ad-Runx3及化疗药物顺铂治疗小鼠肝细胞癌移植瘤,可能通过不同途径及机制作用于肝癌细胞,加速肿瘤细胞凋亡,为肝细胞癌的生物治疗提供新的靶点和全新的联合用药方案。

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