柿子醋贮藏期间褐变及其抑制方法

詹丽娟，范会平，庞凌云，邢涵博，祝美云，李 瑜*

(河南农业大学食品科学技术学院，河南 郑州 450002)

柿子醋贮藏期间褐变及其抑制方法

詹丽娟，范会平，庞凌云，邢涵博，祝美云，李 瑜*

(河南农业大学食品科学技术学院，河南 郑州 450002)

研究柿子醋褐变原因及抑制其褐变方法。利用分光光度计和色差法分析柿子醋在贮藏期间总酚含量、多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)和过氧化物酶(peroxidase，POD)活性以及褐变度的变化，并研究几种抑制剂(NaCl、柠檬酸和L-抗坏血酸)对其褐变抑制的影响。结果表明：柿子醋贮藏期间发生的褐变主要是由于PPO和POD催化氧化总酚类物质引起的酶促褐变。不同质量浓度的褐变抑制剂NaCl、柠檬酸和L-抗坏血酸均显著维持醋液中较高的总酚含量，抑制PPO和POD活性，从而降低褐变度，减缓褐变发生，其中以0.24g/100mL NaCl、溶液1.2g/100mL柠檬酸和0.48g/100mL L-抗坏血酸对柿子醋抑制效果较好。

柿子醋；褐变；抑制剂

柿子醋是以柿子为原料，经微生物发酵酿制而成的，与粮食醋相比营养更为丰富。其富含醋酸、乳酸、苹果酸和琥珀酸等多种有机酸，以及各种氨基酸和生物活性物质，具有较高的营养价值及保健药用功能[1-2]。柿子醋色泽鲜亮、口味醇厚，风味独特[3]，是很有特色的调味佳品。然而，柿子醋在开口使用后或贮藏过程中往往会发生褐变现象，导致色值升高。例如刚生产出来的柿子醋液色值完全符合标准，但经过一段时间的贮藏、运输、尤其是消费者打开食用期间，醋液颜色变深，由透明的浅亮色逐渐变成深红色，甚至红褐色，有时还会出现浑浊现象，严重地影响柿子醋的感官品质和商品价值，甚至还会造成一定的经济损失和影响企业形象。因此，褐变是柿子醋生产加工行业亟待解决的关键技术问题。

褐变是食品贮藏和加工过程中常见的一种变色现象，根据其发生的机制，可分为酶促褐变和非酶促褐变。目前普遍认为酶促褐变是多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)和过氧化物酶(peroxidase，POD)利用氧气将多酚类物质氧化成醌，醌以多聚体形式或与其他物质的结合进一步产生黑色或褐色的色素沉淀，从而导致颜色改变[4-5]。柿子醋液中含有较高的酚类物质如单宁等[3]，据观察，柿子醋随着贮藏时间的延长，颜色逐渐加深，尤其是在打开食用后，褐变明显加速。关于柿子醋发生褐变的原因及对其抑制研究少见报道[3]，因此，本实验通过测定柿子醋贮藏期间褐变度、总酚含量、褐变氧化酶PPO和POD的活性，分析引起柿子醋发生褐变的可能原因，并探讨几种食品常用的褐变抑制剂对柿子醋褐变抑制的效果，以期为解决生产中柿子醋褐变问题提供理论依据和实践指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

成品柿子醋 河南省新乡市八里沟食品有限公司；邻苯二酚、愈创木酚、双氧水、氯化钠、L-抗坏血酸和柠檬酸等为市售分析纯。

1.2 仪器与设备

SC-80C全自动色差仪 北京新恒能分析仪器有限公司；T6新世纪紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；台式高速冷冻离心机 力康发展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 柿子醋中总酚含量、PPO和POD活性以及褐变度的测定

取干燥洁净的三角瓶，分别倒入100mL刚打开的柿子醋液，瓶口用锡箔纸轻轻覆盖，放在室温下，分别在贮藏后的0、1、4、7d测定其褐变度、总酚含量、PPO和POD活性。褐变度用全自动色差计法测定，结果以E和ΔE表示，E代表色度，E值越大，说明被测样品颜色越深，ΔE代表处理醋液与对照醋液之间总色差值的差异，ΔE值越大，说明处理醋液与对照醋液颜色差异也越大，褐变程度越高；总酚的测定参照Waterhouse[6]的方法，结果用每毫升醋液吸光度(A/mL)表示；PPO、POD活性测定参照Zhan等[7]和詹丽娟等[8]的方法，PPO一个酶活力单位(U)定义为每毫升醋液在1min内使OD值升高0.001；POD的一个酶活力单位(U)定义为每分钟在A470处增加的吸光度，即1U＝ΔA470/min，醋液中POD比活力用U/mL表示。测定重复3次，以刚开口的醋液为对照。

1.3.2 褐变抑制剂对柿子醋褐变抑制的研究

选用食品中常用的褐变抑制剂，其类型及质量分数见表1，按照设计质量浓度分别将各种抑制剂加入含有100mL柿子醋液的三角瓶中，瓶口用锡箔纸轻轻覆盖，贮藏在室温下，分别在贮藏后的0、1、4、7d测定其褐变度、总酚含量、PPO和POD相对活性，结果以最初值(0d)的百分率来表示，测定重复3次，以不加抑制剂的醋液为对照。

表1 抑制剂类型及质量浓度Table 1 The types and concentrations of browning inhibitors

2 结果与分析

2.1 柿子醋中总酚含量、PPO和POD比活力以及褐变度的变化

由表2可知，柿子醋中总酚含量较高，且在打开口后，总酚含量随着贮藏时间的延长显著降低。贮藏4d后，总酚含量显著下降，7d后总酚含量下降了8.1%。同时检测到POD和PPO比活力，POD比活力随着贮藏时间延长显著升高，贮藏7d后，POD比活力就由3.08 U/mL增加到3.58U/mL，增加了16.2%，POD比活力在整个贮藏期间一直显示出上升趋势。和POD比活力相似，PPO比活力也随着贮藏时间的延长显著上升，但在贮藏第4天达到最大值，其后又显著下降。色度E值随着贮藏时间延长显著增加，尤其在贮藏4d后，E值显著增加，表明此时柿子醋颜色显著增加。

表2 柿子醋贮藏期间总酚含量、POD和PPO比活力及褐变度的变化Table 2 Changes in total phenol content, POD and PPO specific activities, and browning index of persimmon vinegar during storage

根据上述结果可知，酶促反应可能是导致柿子醋褐变的主要因素之一。柿子醋中含有较高的总酚类物质和较强的酚氧化酶PPO和POD活性。柿子醋开口后，由于空气的进入，导致醋液中溶解一定量的氧气，在氧气的参与下，酚氧化酶PPO和POD能够将底物总酚类物质氧化成醌类物质，随着酚类物质向醌类物质的转化，总酚含量下降。醌类物质再进一步聚合或与别的物质结合，生产颜色较深的物质，从而导致醋液颜色增加，而试验中测定的总酚类物质含量下降，色度E值增加和上述推测一致。

2.2 NaCl对柿子醋中总酚含量、PPO和POD相对活性以及褐变度的影响

柿子醋打开后，随着贮藏时间的延长，总色差值ΔE显著增加，说明柿子醋液颜色随着贮藏时间的延长逐渐加深，褐变加剧。和对照醋液相比，NaCl处理的醋液总色差值ΔE显著降低，其中以0.24g/100mL NaCl处理效果最好，在贮藏后的第4、7天，总色差值分别比对照低46.2%和52.67%(图1A)。总酚含量随着贮藏时间的延长呈下降趋势，和对照相比，NaCl处理的醋液中总酚含量下降较为缓慢，在贮藏后的第7天，NaCl质量浓度为0.08、0.16g/100mL和0.24g/100mL处理的醋液中，总酚含量分别为最初值的98%、99%和97%，而对照醋液中总酚含量为最初值的92%(图1B)。NaCl对PPO相对活性的影响见图1C，由图1C可以看出，柿子醋打开后贮藏期间，PPO相对活性逐渐升高，和对照相比，NaCl处理显著抑制PPO相对活性，尤其是0.24g/ 100mL NaCl处理的醋液，PPO相对活性在贮藏期间增加较缓慢。POD相对活性随着贮藏时间的延长逐渐升高，和对照相比，0.24g/100mL NaCl处理在贮藏后的第7天显著抑制POD相对活性增加(图1D)。

NaCl是食品中常用的调味品，其溶液具有高渗透压作用，一定质量浓度的NaCl可以驱除溶液中的氧气，使酚类底物难以与氧气接触，从而阻止或减缓PPO对底物酚类的氧化，同时高质量浓度的NaCl对酶蛋白有一定的抑制作用[9]，因此常常被用来作为褐变抑制剂。本实验结果也显示NaCl对柿子醋褐变度、PPO和POD相对活性具有显著的抑制作用，能够有效地减缓总酚含量下降，尤其以0.24g/100mL处理效果最佳。

图1 NaCl对柿子醋褐变度(A)、总酚相对含量(B)、PPO(C)和POD(D)相对活性的影响Fig.1 Effect of NaCl on browning index (A), total phenol content (B), PPO (C) and POD (D) activities of persimmon vinegar during storage

2.3 柠檬酸对柿子醋中总酚含量、PPO和POD相对活性以及褐变度的影响

由图2A可以看出，与对照相比，柠檬酸处理的醋液总色差值ΔE显著低于对照醋液，表明柠檬酸处理显著抑制醋液褐变，但不同质量浓度柠檬酸处理间差异不显著。图2B显示，柠檬酸处理的醋液中，总酚含量都高于对照。整个贮藏期间，对照醋液总酚含量下降了约8%，处理醋液总酚含量几乎保持恒定。柠檬酸处理显著抑制醋液中PPO相对活性，其中以1.2g/100mL柠檬酸处理质量浓度对PPO相对活性抑制效果最好。在对照醋液中，PPO相对活性随着贮藏时间的延长逐渐升高，在贮藏的第7天，PPO相对活性增加了16%。而在柠檬酸处理醋液中，PPO相对活性在贮藏期间保持恒定或略微下降，其中以1.2g/100mL柠檬酸处理的醋液中，PPO相对活性最低。柠檬酸对POD相对活性的影响如图2D所示，和PPO相对活性一样，柠檬酸处理显著抑制醋液中POD相对活性，其中以1.2g/100mL的柠檬酸处理质量浓度对POD相对活性抑制效果最好。对照醋液中POD相对活性随着贮藏时间的延长升高，贮藏7d后，其相对活性增加了约16%，而在柠檬酸处理醋液中，POD相对活性在贮藏期间几乎保持恒定。柠檬酸作为常见的食用酸，其抑制褐变的一般机理为螯合酶相对活性中心离子从而降低酶的相对活性，同时通过调节p H值，改变酶作用条件。

图2 柠檬酸对柿子醋褐变度(A)、总酚相对含量(B)、PPO(C)和POD(D)相对活性的影响Fig.2 Effect of citric acid on browning index (A), total phenol content (B), PPO (C) and POD (D) activity of persimmon vinegar during storage

2.4 L-抗坏血酸对柿子醋中总酚含量、PPO和POD相对活性以及褐变度的影响

由图3A可知，和对照相比，L-抗坏血酸显著降低醋液总色差ΔE值，抑制醋液褐变。抗坏血酸对总酚含量的影响如图3B所示，在贮藏期间，抗坏血酸处理显著增加醋液中总酚含量，尤其是在贮藏第1天，抗坏血酸处理的醋液中总酚含量迅速增加，其中以0.48g/100mL抗坏血酸处理总酚增加最快，增加为原来的204%，在随后的贮藏期间，总酚含量逐渐下降，对照醋液中总酚含量在整个贮藏期间呈下降趋势。抗坏血酸处理显著抑制醋液中PPO和POD相对活性，但不同质量浓度抗坏血酸处理之间差异不大(图3C、D)。抗坏血酸是一种天然抗氧化剂和护色剂，其作用机理一般认为其可以作为酚酶相对活性中心铜离子的络合剂，抑制酶的相对活性，也可作为还原剂，将氧化的醌类及其衍生物还原成酚类物质，从而阻止醌类物质进一步聚合形成黑色素类[10]，抗坏血酸甚至可直接被PPO氧化，起到底物竞争抑制作用，同时减少溶液中溶解的氧气。本实验结果显示，抗坏血酸处理能显著增加醋液中总酚含量，抑制酚酶相对活性，其作用可能主要是作为酶抑制和还原剂。但抗坏血酸添加量一般不宜过多，一方面增加产品成本，另外抗坏血酸氧化还会引起非酶促褐变。

图3 L-抗坏血酸对柿子醋褐变度(A)、总酚相对含量(B)、PPO (C)和POD(D)相对活性的影响Fig.3 Effect of L-ascorbic acid on browning index (A), total phenol content (B), PPO (C) and POD (D) activities of persimmon vinegar during storage

3 结论与讨论

柿子醋中总酚含量41.75A/mL，PPO、POD比活力分别36U/mL和3.08U/mL，其较高的总酚含量和较强的酶活性为贮藏期间发生酶促褐变提供必要条件；柿子醋打开口放置7d后，其总酚含量显著下降，PPO和POD活性显著增加，褐变度显著增加。0.24g/100mL NaCl、1.2g/ 100mL柠檬酸和0.48g/100mL L-抗坏血酸对柿子醋褐变具有较好的抑制作用，可作为柿子醋的护色剂使用。

本实验选用抑制剂NaCl、柠檬酸和L-抗坏血酸对柿子醋褐变具有一定的抑制作用，占习娟等[11-12]研究也认为添加柠檬酸可以有效地防止柿子汁色变，但柿子醋是一种调味品，添加NaCl和柠檬酸可能会影响其风味、口感和品质。L-抗坏血酸作为柿子醋首选的护色剂[13]，本研究也发现其具有很好的抑制效果，但一定质量浓度抗坏血酸可能引起氧化反应导致非酶促褐变的发生。此外，单一抑制剂对褐变的抑制效果较多种不同抑制剂的协同作用抑制效果差[11]，因此，还需要在上述单一抑制剂的研究基础上，进一步开展对不同抑制剂组合的协同抑制效果进行研究，为防止柿子醋酶促褐变提供更切实有效的抑制方法。

目前研究普遍认为，防止酶促褐变的主要途径是抑制酶活性、降低底物浓度和降低氧气浓度[14-15]。因此，避免柿子醋在贮藏期间发生褐变的主要方法除了在加工过程中通过加热钝化天然的酶活性[16]，在贮藏期间添加抑制剂之外，还可以在加工过程中通过彻底脱涩减少可溶性单宁含量，从而降低酶促反应底物含量，再结合低氧包装，可有效防止其褐变发生。然而，影响柿子醋褐变的因素很多，褐变的发生由多种褐变类型共同作用的结果，其过程比较复杂，在发生酶促褐变的同时也可能伴随着非酶促褐变，比如美拉德反应、抗坏血酸的氧化分解以及多酚类物质的氧化缩合都可能导致成品醋液发生褐变，因此进一步深入探讨柿子醋褐变的机理及其褐变抑制研究势在必行。

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Browning and Its Inhibition of Persimmon Vinegar during Storage

ZHAN Li-juan，FAN Hui-ping，PANG Ling-yun，XING Han-bo，ZHU Mei-yun，LI Yu*
(College of Food Science and Technology, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

In this study, the content of total phenols, the activities of polyphenol oxdise (PPO) and peroxidase (POD) and browning degree of persimmon vinegar during storage were spectrometically assayed. Meanwhile, the effects of selected inhibitors such as NaCl, citric acid and L-ascorbic acid on the browning of persimmon vinegar were also investigated. The results indicated that the browning of persimmon vinegar during storage was enzymatic browning due to the oxidation of total phenols by PPO and POD in the presence of oxygen. Browning inhibitors such as NaCl, citric acid and L-ascorbic acid could maintain the content of total phenols, significantly inhibit the activities of PPO and POD, and delay the browning of persimmon vinegar during storage. In addition, 0.24 g/100 mL NaCl, 1.2 g/100 mL citric acid and 0.48 g/100 mL L-ascorbic acid revealed better inhibitory effect.

persimmon vinegar；browning；browning inhibitors

TS255

A

1002-6630(2011)16-0370-05

2011-06-01

詹丽娟(1978—)，女，讲师，博士，研究方向为果蔬贮藏保鲜与加工。E-mail：ljzhan@hotmail.com

*通信作者：李瑜 (1976—)，女，副教授，博士，研究方向为果蔬贮藏保鲜与深加工。E-mail：liyuliyu76@163.com