双水相萃取法分离纯化狗枣猕猴桃叶总黄酮

王 倩，贾长虹*，常丽新，唐红梅

(河北联合大学生命科学学院，河北 唐山 063009)

双水相萃取法分离纯化狗枣猕猴桃叶总黄酮

王 倩，贾长虹*，常丽新，唐红梅

(河北联合大学生命科学学院，河北 唐山 063009)

采用聚乙二醇-硫酸钠双水相体系分离纯化狗枣猕猴桃叶黄酮，确定其双水相体系组成24% PEG400-15% Na2SO4，并通过单因素试验和正交试验探讨黄酮粗提液质量浓度、KCl添加量、pH值和温度对萃取效果的影响。结果表明：黄酮粗提液质量浓度和pH值对黄酮萃取效果影响最大，其次为KCl添加量，温度的影响较小；最佳萃取条件为粗提液质量浓度C0、KCl添加量2%、pH9、25℃。在此条件下，狗枣猕猴桃叶黄酮主要分布在上相，分配系数为24.31，萃取率达到96.90%。此方法操作简单方便、成本低，是黄酮类化合物分离纯化的一种有效方法。

双水相体系；分离纯化；狗枣猕猴桃叶；黄酮

狗枣猕猴桃是一种野生的猕猴桃科植物，别名深山木天寥、狗枣子，属多年生落叶藤本植物，主要分布于我国东北、华北、华中、西北、西南部以及朝鲜、日本、俄罗斯等国。其叶中含有多种化学成分，主要有生物碱、咖啡酸、香豆素、黄酮类物质等[1]，因此可入药，具有较高的经济价值和药用价值。尤其黄酮类化合物含量丰富，具有抗氧化、抗肿瘤、抗过敏、延缓衰老及降血糖、降血压、抗炎镇痛等作用[2]。

双水相萃取技术是一种高效而温和的分离技术，操作简便，且容易放大，能够保持生物活性，因此被广泛应用于生物产品的分离和纯化[3-5]。近年来，双水相萃取技术在黄酮类化合物的分离纯化中得到了应用[6]，本实验采用聚乙二醇-硫酸铵双水相体系分离纯化狗枣猕猴桃叶黄酮，以期为植物中黄酮的分离纯化与开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

狗枣猕猴桃叶：2009年9月底采自河北省雾灵山区。将采集的狗枣猕猴桃叶先用自来水洗净，再用蒸馏水洗3遍，用滤纸或纱布吸干表面水，于90℃灭酶15min，在60～65℃烘干至脆。将烘干的狗枣猕猴桃叶粉碎，过筛，备用。

聚乙二醇(PEG400、600、1000、2000、4000)、硫酸钠、无水乙醇、氯化钠、盐酸、氢氧化钠均为分析纯。

1.2 仪器与设备

HJ-3恒温磁力搅拌器 江苏金坛医疗仪器厂；JA2003电子天平 上海上平仪器公司；MVS-1型旋涡混合器 北京金北德工贸有限公司；KQ-100B型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；800-离心机 江苏金坛城西小阳电子仪器厂；PHS-3C型酸度计 上海理达仪器厂；752型紫外-可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；电热恒温水浴锅 金坛市精达仪器制造厂；202-0台式电热干燥箱 天津泰斯特仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 狗枣猕猴桃叶黄酮提取液的制备

先将过100目筛的狗枣猕猴桃叶粉末用石油醚于索氏提取器中抽提7h脱去其中的脂肪。烘干，准确称取一定量脱脂后的狗枣猕猴桃叶粉末，按料液比1∶40(g/ mL)加入体积分数45%乙醇溶液，室温浸泡1h，50℃超声处理25min，再于室温浸泡1h，50℃超声处理25min，连续提取2次，过滤，合并滤液，经旋转蒸发仪浓缩，而后用醇沉法(95%乙醇溶液)除去糖类、蛋白质等大分子杂质。于40℃减压浓缩，浓缩液质量浓度C0为3.4284mg/mL，将浓缩液用去离子水调配成不同质量浓度的样品溶液，备用。

1.3.2 PEG-Na2SO4双水相体系的配制

称取一定量的PEG、氧化钠、蒸馏水和一定体积的黄酮粗提液于小烧杯中，使双水相总质量为10g，磁力搅拌至两相充分混匀并调节pH值，2000r/min离心5min，以加速相分离过程。准确测定上、下相体积，用胶头滴管分别吸取上、下相溶液进行分析，测定上下相中狗枣猕猴桃叶黄酮的含量[用NaNO2-Al(NO3)3比色法测定][7]。

式中：Vu为上相体积/mL；Vd为下相体积/mL；Cu为上相黄酮的质量浓度/(mg/mL)；Cd为下相黄酮的质量浓度/(mg/mL)。

1.3.3 PEG-Na2SO4双水相体系的确定

以PEG平均相对分子质量、PEG质量分数、Na2SO4质量分数3项确定双水相体系[8-9]。

1.3.4 影响狗枣猕猴桃叶黄酮萃取的因素

1.3.4.1 单因素试验设计

在确定了双水相体系组成后，探讨黄酮粗提液质量浓度、KCl添加量、pH值、温度对狗枣猕猴桃叶黄酮萃取效果的影响[10]。

1.3.4.2 正交试验设计

根据单因素试验结果，设计黄酮粗提液质量浓度、KCl添加量、pH值、温度4因素3水平正交试验，确定双水相体系萃取狗枣猕猴桃叶黄酮的最佳工艺。

2 结果与分析

2.1 PEG平均相对分子质量对双水相体系的影响

选择24% PEG(相对分子质量为400、600、1000、2000、4000)，20% Na2SO4和3mL质量浓度为C0/4的狗枣猕猴桃叶黄酮粗提液组成双水相体系，在室温(25℃)条件下，磁力搅拌至两相充分混匀并调节pH7，再于2000r/min离心5min，而后对上、下相溶液进行分析。

图1 PEG平均相对分子质量对双水相体系的影响Fig.1 Effect of PEG molecular weight on partition coefficient and extraction efficiency

由图1可知，Na2SO4对不同相对分子质量的PEG均具有良好的分相能力，分配系数和萃取率随PEG相对分子质量的增大而降低。这是由于随着PEG相对分子质量的降低，分子内极性基团(如羟基等)的比例相对较高，亲水性程度增强，从而导致体系黏度减小[11]。在PEG400时分配系数和萃取率最大，说明狗枣猕猴桃叶黄酮亲水性较强，因此选择PEG400。

2.2 PEG质量分数对双水相体系的影响

选取9%、12%、15%、18%、21%、24%、27%、30% PEG400，21% Na2SO4和3mL质量浓度为C0/4的狗枣猕猴桃叶黄酮粗提液组成双水相体系，在室温(25℃)条件下，磁力搅拌至两相充分混匀并调pH7，2000r/min离心5min，对上下相溶液进行分析。

由图2可知，PEG400质量分数过低时，接近临界点，不易形成双水相体系；随着PEG400质量分数的增大，体系逐渐远离临界点，而使两相差别增大，易于形成双水相。分配系数和萃取率随PEG400质量分数的增加而增大，但PEG400质量分数过大时，体系黏度增大，阻止相间分子转移的能力增加，影响传质，导致分配系数下降，从而影响萃取率。因此，选择PEG400的最佳质量分数为24%。

图2 PEG400质量分数对双水相体系的影响Fig. 2 Effect of PEG400 concentration on partition coefficient and extraction efficiency

2.3 Na2SO4质量分数对双水相体系的影响

分别选取9%、12%、15%、18%、21%、24%、27%、30% Na2SO4，24% PEG400和3mL质量浓度为C0/4的狗枣猕猴桃叶黄酮粗提液分别组成双水相体系，在室温(25℃)条件下，磁力搅拌至两相充分混匀并调pH7，2000r/min离心5min，对上下相溶液进行分析。

图3 Na2SO4质量分数对双水相体系的影响Fig.3 Effect of Na2SO4 concentration on partition coefficient and extraction efficiency

由图3可知，随着Na2SO4质量分数的增加，分配系数和萃取率先是逐渐上升，当质量分数达到15%时呈下降趋势。可见，Na2SO4质量分数影响双水相体系，可以改变各相中成相物质的组成和相比，从而影响黄酮在上相中的分配，导致分配系数和萃取率随Na2SO4质量分数的增加而下降。因此Na2SO4的最佳质量分数选择15%。

2.4 单因素试验

2.4.1 粗提液质量浓度对狗枣猕猴桃叶黄酮萃取效果的影响

将24% PEG400-15% Na2SO4和3mL质量浓度分别为C0、C0/2、C0/4、C0/6、C0/8的狗枣猕猴桃叶黄酮粗提液组成双水相体系，调节pH7，在室温(25℃)下，磁力搅拌至两相充分混匀，2000r/min离心5min，对上下相溶液进行分析。

图4 粗提液质量浓度对双水相体系的影响Fig.4 Effect of crude extract concentration on partition coefficient and extraction efficiency

由图4可知，分配系数和萃取率随粗提液质量浓度的降低而降低。可见，粗提液的质量浓度影响上下相的分配，当质量浓度为C0时萃取率最大。因此，确定粗提液质量浓度最佳为C0。

2.4.2 KCl质量分数对狗枣猕猴桃叶黄酮萃取效果的影响

将24% PEG400-15% Na2SO4、3mL质量浓度为C0的狗枣猕猴桃叶黄酮粗提液作为双水相体系，在pH7、室温(25℃)条件下，分别加入0%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0% KCl，磁力搅拌至两相充分混匀，2000r/min离心5min，对上下相溶液进行分析。

图5 KCl质量分数对双水相体系的影响Fig.5 Effect of KCl concentration on partition coefficient and extraction efficiency

由图5可知，随着KCl质量分数增加，分配系数变化基本与萃取率的变化同步。无机盐的加入可以改变两相间的电位差和相比，缩短了分相时间，提高了相分离速度，从而增加了黄酮在上相的分配，但盐质量分数增加到一定程度后，萃取相的极性增强，使黄酮的溶解度下降导致出现盐析现象，使分配系数降低[12]。由实验结果可知，KCl添加量为2%时，萃取率最高。因此，KCl最佳质量分数选择2%左右为宜。

2.4.3 pH值对狗枣猕猴桃叶黄酮萃取效果的影响

将24% PEG400、15% Na2SO4和3mL质量浓度为C0的狗枣猕猴桃叶黄酮粗提液组成双水相体系，添加2%的KCl，在室温(25℃)条件下，用HCl和NaOH调节体系pH值，在pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0条件下，磁力搅拌至两相充分混匀，2000r/min离心5min，对上下相溶液进行分析。

图6 pH值对双水相体系的影响Fig.6 Effect of pH value on partition coefficient and extraction efficiency

由图6可知，pH＜9时，随着pH值增大分配系数和萃取率逐渐增大；pH9时分配系数和萃取率达最大；当pH＞9时，分配系数和萃取率随pH值的增大而减小。这是因为pH值改变了黄酮的电荷性质，也改变了无机离子的分配情况，从而影响两相之间的电位差。在PEG-Na2SO4双水相体系中，上相电位为正，下相电位为负，当pH＞7时，狗枣猕猴桃叶黄酮带负电，随着pH值的升高，体系的相间电位差增加，使黄酮分配到电位为正的上相，则分配系数随之上升。但碱性过强时，会破坏黄酮母核，导致黄酮的萃取率降低。当pH＜7时，黄酮的电离平衡受到影响，并吸附H+而携带正电荷，随pH值的降低，黄酮开始向电位为负的下相富集，分配系数下降[13]，因此选择pH9。

2.4.4 温度对狗枣猕猴桃叶黄酮萃取效果的影响

将24% PEG400、15% Na2SO4和3mL质量浓度为C0的狗枣猕猴桃叶黄酮粗提液作为双水相体系，添加2% KCl，在pH9时，分别在温度25、30、35、40、45、5 0、5 5、6 0℃条件下，磁力搅拌至两相充分混匀，2000r/min离心5min，对上下相溶液进行分析。

图7 温度对双水相体系的影响Fig.7 Effect of extraction temperature on partition coefficient and extraction efficiency

由图7可知，萃取率和分配系数均随温度的升高而降低。升温后会加快相分离的速度，有利于双水相的形成，但温度的升高也会增大溶质的扩散作用，从而影响分配系数，导致黄酮萃取率逐渐降低[14]，因而选择25℃。

2.5 狗枣猕猴桃叶黄酮提取工艺正交试验

表1 萃取工艺确定L9(34)正交试验因素水平表Table 1 Factors and their coded levels in orthogonal array design

表2 萃取工艺确定正交试验设计及结果Table 2 Orthogonal array design and corresponding experimental results

从表2可以看出，粗提液质量浓度、KCl添加量、pH值、温度对狗枣猕猴桃叶黄酮萃取率均具有一定的影响，影响因素大小顺序为A＞C＞B＞D，即影响萃取率的主要因素是粗提液质量浓度和pH值，其次为K C l添加量，温度的影响较小。最佳萃取条件为A1B2C3D1，即pH9、温度25℃、KCl添加量2%、粗提液质量浓度为C0(即3.4284mg/mL)。

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis of extraction efficiency of total flavonoids with various process conditions

由表3方差分析可以看出，粗提液质量浓度和pH值的P值均小于0.01，KCl添加量的P值小于0.05，温度的P值大于0.05。表明粗提液质量浓度和pH值对狗枣猕猴桃叶黄酮萃取率的影响极显著，KCl添加量影响显著，而温度影响不显著，通过F值的大小验证了正交试验极差分析的A＞C＞B＞D结论，即影响狗枣猕猴桃叶黄酮萃取率的因素顺序为粗提液质量浓度＞pH值＞KCl添加量＞温度。

2.6 最佳工艺条件验证

根据所确定的最佳操作条件，在24% PEG400、15% Na2SO4、2% KCl、pH9、25℃条件下，以3mL质量浓度为C0的粗提液进行5次平行实验。最佳工艺条件验证结果为分配系数K＝24.31、萃取率96.90%。由验证实验结果可知，实验重现性较高，说明该方法稳定可行。

3 结 论

实验结果表明，双水相中P E G 4 0 0质量分数、Na2SO4质量分数、pH值、KCl添加量及温度等因素都对双水相体系的相比、分配系数及黄酮的萃取率有一定影响，实验确定萃取分离狗枣猕猴桃叶黄酮的双水相体系组成为24% PEG400和15% Na2SO4；黄酮粗提液质量浓度和pH值对黄酮萃取效果影响最大，其次为KCl添加量，而温度的影响较小。最佳萃取条件是3mL质量浓度为C0(即3.4284mg/mL)的粗提液、KCl添加量2%、pH9、温度25℃，萃取率可达0.9690。本实验采用PEG-Na2SO4双水相体系萃取分离狗枣猕猴桃叶黄酮是可行的。

该法具有萃取率高、分相快、温度低、易于操作等优点，为黄酮类化合物萃取分离的一种有效方法。但目前对该技术的研究还不成熟，其过程仍存在易乳化；水溶性高聚物大多黏度较大；不易定量控制；高聚物回收困难等问题[15]，因此还有待进一步研究。

[1]赵瑞艳, 付钓钧, 张海军. 狗枣猕猴桃的开发利用[J]. 中国林业, 2007 (12)∶ 42.

[2]曹纬国, 刘志勤, 邵云, 等. 黄酮类化合物药理作用研究进展[J]. 西北植物学报, 2003, 23(12)∶ 2241-2247.

[3]邓凡政, 郭东方. 芦丁在离子液体双水相中分配性能[J]. 应用化学, 2007, 24(7)∶ 838-840.

[4]HATTI-KAUL R. Aqueous two-phase systems a general overview[J]. Biomedical and Life Sciences, 2001, 19(3)∶ 269-277.

[5]RITO-PALOMARES M. Practical application of aqueous two-phase partition to process development for the recovery of biological products [J]. Journal of Chromatography B, 2004, 807(1)∶ 3-11.

[6]董树国, 赖宏伟, 陆钊. 双水相萃取在黄酮类化合物分离分析中的应用[J]. 广州化工, 2009, 37(7)∶ 43-44.

[7]石慧, 陈媛梅. PEG/(NH4)2SO4双水相体系在加杨叶总黄酮萃取分离中的应用[J]. 现代生物医学进展, 2008, 8(5)∶ 854-857.

[8]卢俊彩, 崔岩岩, 陈火林, 等. 丙酮-硫酸铵双水相体系分离纯化红花红色素[J]. 化学研究与应用, 2007, 19(6)∶ 679-682.

[9]霍清. 葛根素双水相体系中的分配特性及分配系数的关联[J]. 沈阳医科大学学报, 2006, 23(3)∶ 139-144.

[10]LEE C K, SANDLER S I. Vancomycin partitioning in aqueous twophase systems∶ effects of pH, salts, and an affinity ligand[J]. Biotechonlogy and Bioengineering, 1990, 35(4)∶ 408-416.

[11]谢涛, 易元龙, 廖安平, 等. 双水相萃取三七中三七皂昔的研究[J].中药材, 2008, 31(4)∶ 535-537.

[12]赵晓莉. 柿叶黄酮类化合物提取分离研究[D]. 西安∶ 西北工业大学, 2005.

[13]王志辉. 双水相体系对葛根中葛根素的萃取技术的研究[D]. 南昌∶ 南昌大学, 2005.

[14]赵爱丽, 陈晓青, 蒋新宇. 应用双水相萃取法分离黄芩苷的研究[J].中成药, 2008, 30(4)∶ 498-501.

[15]董树国, 赖红伟, 陆钊. 双水相萃取在黄酮类化合物分离分析中的应用[J]. 广州化工, 2009, 37(7)∶ 43-44.

Optimization of Aqueous Two-phase Extraction of Total Flavonoids from Actinidia kolomikta Leaves

WANG Qian，JIA Chang-hong*，CHANG Li-xin，TANG Hong-mei
(College of Life Sciences, Hebei United University, Tangshan 063009, China)

An aqueous two-phase system composed of 24% PEG400 and 15% Na2SO4was used to extract total flavonoids from the crude ethanol extract of Actinidia kolomikta leaves. The effects of crude extract concentration, KCl amount, pH and extraction temperature on the extraction efficiency of total flavonoids were explored by one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods. The results showed that crude extract concentration and pH were major affecting factors and KCl, and extraction temperature exhibited less effect on the extraction efficiency of total flavonoids. The optimal aqueous two-phase extraction conditions were crude extract concentration of C0, KCl amount of 2%, pH of 9 and extraction temperature of 25 ℃. Under the optimal extraction conditions, total flavonoids from Actinidia kolomikta leaves was mainly distributed in the upper phase with a distribution coefficient of 24.31 and an extraction rate of 96.90%. Therefore, this method can provide a simple, convenient, economical and highly efficient strategy for the extraction of total flavonoids.

aqueous two-phase system；extraction and purification；Actinidia kolomikta leaves；flavonoids

TS201.1

A

1002-6630(2011)16-0167-05

2010-11-06

河北省科技支撑计划项目(07220701D-5)

王倩(1982—)，女，硕士研究生，研究方向为植物天然活性成分。E-mail：wqvictor2008@sohu.com

*通信作者：贾长虹(1966—)，女，副教授，硕士，研究方向为天然产物。E-mail：jiachanghong66@163.com