人类Gfi1基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

黄 敏，欧东梅，徐金环，张晓梅，张义成

(1、华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科，湖北 武汉 430030；2、广州军区武汉总医院神经内科，广东 广州；3、华中科技大学同济医学院附属同济医院血液科)

独立生长因子Gfi1是一种锌指阻遏子，其位点是最常见的逆转录病毒插入位点之一[1]，在与Pim-1或Myc的共同作用下可显著加速T细胞淋巴瘤的发展[2]，我们采用SYBR GreenⅠ染料法通过建立实时荧光定量PCR的标准品质粒绘制标准曲线用于检测Gfi1mRNA的表达，实现样品拷贝数的准确定量。

1 材料与方法

1.1 实验材料 大肠杆菌E.coli DH5ɑ由本室保存；含有目的基因Gfi1cDNA的真核表达质粒plox-Gfi1由本室构建，Gfi1cDNA两端带有BamHⅠ酶切位点。

1.2试剂 限制性内切酶BamHⅠ为大连宝生物公司；胰蛋白胨和酵母提取物为英国Oxoid公司；Taq酶为 Fermentas公司；SYBR Green I for real-time PCR液为日本TOYOBA公司；质粒小量提取纯化试剂盒为北京博大泰克生物基因技术有限责任公司。

1.3 仪器 ABI公司stepone荧光定量PCR仪；美国Biometra公司4800型PCR扩增仪；美国Beckman公司DU70型紫外分光光度仪；Alpha Innotech凝胶电泳分析系统。

1.4 目的片断引物的设计、合成 应用软件oligo6.0，根据GenBank收录的Gfi1mRNA全序列NM005263进行设计，引物跨越内含子，避免基因组污染影响结果，目的片断Gfi1长度为176bp，引物由上海博道生物技术公司合成。引物序列：上游引物：5＇-AGACCCTTTGCCTGCGAGATGTGC-3＇，下游引物：5＇-TAGGGCCGAGTGTCTGAGTGGATA-3＇。用无菌双蒸水将引物配制成100pmol/μl的储存液-80℃冰箱保存备用。

1.5 目的基因Gfi1cDNA质粒plox-Gfi1的鉴定 质粒plox-Gfi1经BamHⅠ酶切和PCR扩增及测序鉴定。 酶切反应体系①10×缓冲液：2μl； ②plox-Gfi1：5μl；③BamHⅠ酶：1μl；④加灭菌蒸馏水至 20μl。酶切反应条件：37℃酶切2h。PCR鉴定上下游引物分别 是 5＇-CTGGATCCCCATGCCGCGCTCATTTCTCG TCA AAAG-3＇；5＇-GCGGATCCTCATTTGAGCCCAT GC TGCGTCTCCCGGTG-3＇。 PCR 体系为：①5×Taq缓冲液：5μl； ②MgCl2：3μl ； ③dNTP(10mmol/L)：0.5μl；④plox-Gfi1 质粒 DNA 模板 ：1μl；⑤上游引物(10pmol/μl)：1μl；⑥下游引物(10pmol/μl)：1μl；⑦Taq酶 ：1.5μl；⑧加灭菌蒸馏水至 50μl。 PCR 反应条件：预变性 95℃ 5min，变性 94℃ 30s，退火 55℃1min，延伸72℃ 2min，共35个循环，循环后 72℃延伸10min。将酶切和PCR鉴定正确的的克隆送上海博道生物技术有限公司进行序列分析。

1.6 标准品质粒拷贝数的换算 小量抽提纯化质粒plox-Gfi1，按1:100的稀释度在紫外分光光度计中测定260nm和280nm的OD值，得出质粒浓度为0.845μg/μl，根据公式[质粒浓度(g/μl)/(660×质粒长度 bp)]×6.022×1023(copies/μl)换算为 6.36×109copies/μl。

1.7 标准曲线和熔解曲线的建立 以6.36×109copies/μl的质粒为母液，连续10倍梯度稀释成6.36×102～6.36×108copies/μl的梯度浓度标准品， 采用SYBR Green I荧光定量PCR法对以上七个稀释梯度的标准品质粒模板进行扩增。定量PCR反应体系包括： ①2×SYBR GreenⅠ液：5μl； ②上游引物(10pmol/ul)：0.2μl；③下游引物(10pmol/μl)：0.2μl；④标准品质粒DNA模板：1μl； ⑤加灭菌蒸馏水至10μl。扩增条件为： 95℃预变性 1 min，95℃变性15s，60℃退火 15s，72℃延伸 45s，共 40 个循环，在每个循环的延伸末检测荧光信号。随着PCR仪在每个循环结束后测定的吸光值就得到了以标准品浓度的对数值为横坐标，Ct值为纵坐标的标准曲线。反应结束后进行熔解曲线分析，95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s，每隔0.3℃测定吸光值。这样就得到了PCR产物的熔解曲线，以了解反应的特异性，保障测定的结果的准确可靠。

1.8 电泳检测PCR扩增产物 为了验证SYBR GreenⅠ染料方法的特异性，我们将扩增产物在25g/L琼脂糖凝胶中进行电泳。一旦PCR产物的长度正确并未见杂带，则仅用实时定量PCR熔解曲线中的熔解温度(Tm)监测反应特异性即可。

1.9 标准品稳定性与重复性 将每个梯度的标准品平行操作5次和在5d内分别测定，计算Ct平均值、标准差，获取其批内变异系数和批间变异系数，比较同一浓度、同一次反应不同反应管间的批内变异及不同时间反应结果的批间变异。

2 结果

2.1 质粒plox-Gfi1鉴定

重组质粒plox-Gfi1经BamHⅠ单酶切及PCR扩增后均获得了符合预期大小的条带(约1200bp)。将含重组质粒的阳性克隆送上海博亚公司自动测序仪进行测定,结果经blast进行分析，显示插入片断序列与基因库收录的Gfi1 (收录号NM005263)一致。

2.2 Gfi1质粒标准曲线的建立

图1 实时荧光定量PCR扩增曲线

当质粒 DNA 浓度在 6.36×102～6.36×108copies/μl范围时，曲线为一组典型的倒S型曲线(图1)，模板浓度越高，循环阈值越小，各梯度起始模板拷贝浓度与循环阈值之间呈良好的线性关系。随循环数的增加，荧光信号逐渐增强，而当循环数达到一定程度时，荧光强度达到平台。以标准品稀释滴度的对数值为横坐标，以循环阈值为纵坐标建立实时定量PCR的标准曲线 (图2)，其线性回归方程为y=-3.441x+40.314，y为Ct值，x为待测样品浓度的对数值，标准曲线斜率为-3.441，γ2=0.996。

图2 实时荧光定量PCR标准曲线

2.3 实时荧光扩增熔解曲线

图3 标准品质粒plox-Gfi1熔解曲线

根据所得的熔解曲线(图3)，在90℃左右出现单一的熔解峰，曲线平稳，峰尖且窄，提示各浓度质粒熔解温度均一，扩增产物特异性好，以此为基础进行定量是可靠的。

2.4 方法的特异性与灵敏度

将PCR产物用25g/L琼脂糖凝胶电泳在176 bp处获得一条带，未发现明显的杂带，荧光定量PCR反应线性范围广，可达7个log值的范围(6.36×102～6.36×108)，敏感性高，起始拷贝数在 6.36×102就可获得良好的定量效果。为对样品进行准确定量奠定了良好的基础。而采用常规PCR检测标准品的起始拷贝数为 6.36×104copies/μl(图 4)。

图4 标准品质粒plox-Gfi1常规PCR扩增电泳结果

2.5 稳定性与重复性

将 7 个不同稀释度(6.36×108～6.36×102copies/ml)的标准品同批次各重复5管检测，得其批内CV%为1.35%～3.61%。将上述7个标准品分5批次在不同时间进行检测，得其批间CV%为1.49%～3.42%(表1)。表明标准品及该实验体系具有较好的稳定性和重复性。

表1 标准品质粒plox-Gfi1稳定性与重复性评价

3 讨论

Gfi1在人类基因组定位于染色体1p22，其羧基端含有6个C2H2的锌指DNA结构域，氨基端含有由20-氨基酸组成的SNAG结构域，SNAG是高度保守的，主要发挥核定位和转录阻遏作用[3]。Gfi1可以使T细胞系不依耐IL-2就能生存从而在小鼠T细胞淋巴瘤形成中发挥重要作用[4]。近来有研究表明MDS伴外周血低白细胞的患者Gfi1基因在mRNA水平的表达是降低的[5]，但是Gfi1mRNA在其它恶性血液病中绝对表达量的情况国内尚无报道。

实时荧光定量PCR是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。本实验采用SYBR GreenⅠ染料法通过建立质粒标准品绘制标准曲线来实现Gfi1基因的绝对定量。SYBR greenⅠ是一种不对称箐类荧光素，非特异地嵌合在DNA双螺旋结构的小沟内，与双链DNA结合后，荧光大大增强，当它从DNA双链上释放出来时，荧光迅速下降。因此，SYBR GreenⅠ产生的荧光信号强度代表了双链DNA的数量，从而实现对特异性产物的鉴别和定量[6]。但是SYBR GreenⅠ没有特异性，对PCR反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会结合产生荧光。如果结合熔解曲线，就能很好的判断反应的特异性。

本实验采用SYBR GreenⅠ法成功建立了检测人Gfi1mRNA的实时荧光定量PCR标准曲线，公式为y=-3.441x+40.314，斜率为-3.441，相关系数为0.996，研究者们通过实践总结提出斜率在-3.0～-3.9，相关系数＞0.95的标准曲线已是比较满意的实验结果[7]，每个梯度浓度的标准品质粒均呈现典型的S形动力学曲线，可见本实验体系线性范围广，可达 7 个 log 值的范围 (6.36×102～6.36×108copies/μl)，敏感性高，起始拷贝数在6.36×102copies/μl就可获得良好的定量效果，而普通的PCR检测至少要6.36×104copies/μl才能检测得到。熔解曲线分析显示在90℃左右有一单一的峰，峰的形状锐利，说明引物的特异性好。为对样品进行准确定量奠定了良好的基础。

通过对标准品进行的重复性实验，我们了解每个稀释度标准品的Ct值基本恒定，批内和批间变异系数分别为1.35%～3.61%和1.49%～3.42%，说明本实验体系有较好的重复性与稳定性，而且采用重组质粒作为标准品可以长期稳定保存，与目的基因同源性高，两者扩增效率一致确保定量结果可靠。

本研究以plox-Gfi1质粒为模板，建立了SYBR GreenⅠ实时荧光PCR定量的实验方法与反应体系，该法快速有效、灵敏度高、特异性好，Ct值线性范围广，可重复性好，为Gfi1基因的进一步研究提供了可靠手段。

[1]Gilks CB,Bear SE,Grimes HL,et al.Progression of interleukin-2(IL-2)-dependent rat T cell lymphoma lines to IL-2-independent growth following activation of a gene(Gfi-1)encoding a novel zinc finger protein[J].Mol Cell Biol,1993,13(3):1759-1768.

[2]Schmidt T,Karsunky H,Gau E,et al.Zinc finger protein GFI-1 has low oncogenic potential but cooperates strongly with pim and myc genes in T-cell lymphomagenesis[J].Oncogene,1998,17(20):2661-2667.

[3]Grimes HL,Chan TO,Zweidler-McKay PA,et al.The Gfi-1 protooncoprotein contains a novel transcriptional repressor domain,SNAG,and inhibits G1 arrest induced by interleukin-2 withdrawal[J].Mol Cell Biol,1996,16(11):6263-6272.

[4]Zornig M,Schmidt T,Karsunky H,et al.Zinc finger protein GFI-1 cooperates with myc and pim-1 in T-cell lymphomagenesis by reducing the requirements for IL-2[J].Oncogene,1996,12(8):1789-1801.

[5]Huh HJ,Chae SL,Lee M,et al.CD34,RAB20,PU.1 and GFI1 mRNA expression in myelodysplastic syndrome[J].Int JLab Hematol,2009,31(3):344-351.

[6]Yin JL,Shackel NA,Zekry A,et al.Real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR)formeasurement of cytokine and growth factor mRNA expression with fluorogenic probes or SYBR GreenⅠ[J].Immunol Cell Biol,2001,79(3):213-221.

[7]van der Velden VH,HochhausA,Cazzaniga G,et al.Detection of minimal residual disease in hematologic malignancies by real-time quantitative PCR:principles,approaches,and laboratory aspects[J].Leukemia,2003,17(6):1013-1034.