CTGF在阴茎体型及会阴型尿道下裂患者包皮组织中的表达

匡仁锐，朱遵伟 ，邓 君 ，李 贺，崔苏萍

(1、南昌大学第一附属医院泌尿外科；2、江西省人民医院泌尿外科，江西 南昌 30006)

尿道下裂是一种因前尿道发育不全而致尿道开口达不到正常位置的阴茎畸形,是男童泌尿生殖系统最常见的先天性畸形之一，目前其发病机制尚不明确。CTGF是近年来备受重视的促纤维化蛋白因子，可通过基质金属蛋白酶参与基质的重塑，在机体的各类创伤修复过程中发挥重要作用，病理状态下CTGF可以促进细胞外基质的分泌和成纤维细胞增生，参与器官纤维化进程[1]。本研究希望明确CTGF与阴茎体型及会阴型尿道下裂的关系，从而推测CTGF可能在尿道下裂的发生发展过程中发挥重要的调控作用。

1 材料与方法

1.1 临床资料 选择2008年4月至2010年12月在南昌大学第一附属医院住院和门诊治疗的尿道下裂及包皮手术患者32例。尿道下裂组16例，平均年龄6.3(3～17)岁。根据阴茎伸直后尿道外口位置分为轻型(阴茎头型、冠状沟型、阴茎远侧型)、中型(后2/3阴茎体型)、重型(阴茎阴囊型、阴囊型、会阴型)。其中中型11例，重型5例，均为散发性患者，均无泌尿生殖系统的其它异常。对照组16例，均为接受包皮环切术的患者，平均年龄16(3～18)岁，无其它合并症存在。

1.2 实验方法

1.2 .1标本处理 组织样品为术中留取的中度(阴茎体型)和重度(会阴型)尿道下裂患者包皮组织和同龄正常患者包皮环切术的包皮组织(每组各16例)，分别做好标记后装入冻存管，立即置于液氮罐中保存。1.2.2总RNA抽提 收集组织标本，按Trizol试剂说明书提取总RNA。所提总RNA行紫外分光光度计检测A260/A280在1.8～2.0之间，并计算浓度，-80℃保存备用。

1.2 .3 半定量 RT–PCR Trizol法提取总 RNA，以RT–PCR法对包皮组织CTGF的mRNA表达进行检测。一步法RT-PCR试剂盒购自美国Fermantas公司，CTGF以及GAPDH引物由上海生工生物工程公 司 合 成 ，CTGF 上 游 引 物 ：5＇-GAAGGGCAAAA AGTGCATCC-3＇， 下 游 引 物 ：5＇-GACAGTTGTAATGGCAG-GCA-3＇， 扩增产物大小为 235bp。RT-PCR过程简述如下：取约1μg总RNA加入反应体系为：5×buffer 4μl，10mmol/L dNTPs 2μl， 上下游引物各 0.5μl，M-Mulv 逆转录酶 1μl，RNase 抑制物1μl，加无核酸酶水至体积 20μl，充分混匀。 按 48℃逆转录反应 45min，94℃变性 2min，94℃变性 1min，55℃退火 1min，72℃延伸 2min共 30个循环，再72℃延伸5min，所得产物于2%琼脂糖凝胶电泳，拍照，用Quantity One图像分析软件进行CTGF和GAPDH条带灰度分析，计算CTGF/GAPDH值。

1.2 .4 Western blot检测CTGF在蛋白水平上的表达变化：取出各组的包皮组织，重量约为40mg，用匀浆器在冰浴中研磨成浆，加入RIPA裂解液300ml，冰浴 20min，4℃下离心，12000g离心 30min， 分装蛋白，-80℃保存，另留取少量采用Bradford法蛋白定量。各样本均取50μg总蛋白经12%SDS-PAGE后转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭后，用CTGF特异性一抗 (1:500稀释的兔抗人CTGF多克隆抗体，美国Abcam公司)孵育，4℃过夜。二抗(辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG1:4000)室温孵育1h后加入ECL显色底物，暗室曝光，显影，定影X胶片扫描，最后通过Quantity One软件进行图像分析，并按得出的数据进行统计学分析及作图。

1.2 .5 统计学方法 数据结果以均数±标准差(x±s)表示。统计方法采用SPSS 13.0统计软件中的两独立样本t检验进行分析，以 P＜0.01表示有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-PCR法检测CTGF mRNA的表达变化CTGFmRNA表达水平在散发的单纯性尿道下裂患者中明显高于对照组,两组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。两组组织中RT-PCR的电泳条带灰度CTGF/GAPDH 的比值分别为 0.28±0.05，0.85±0.04，如图1，2所示。

图1 两组组织中CTGFRT-PCR检测结果

图2 CTGF基因在两组组织中的表达变化

2.2 Western blot检测CTGF蛋白的表达变化 CTGF蛋白条带在尿道下裂组较对照组蛋白条带深，提示尿道下裂组中CTGF蛋白水平表达升高。两组中CTGF/β-actin 灰 度 比 值 分 别 为 0.45±0.04、1.24±0.08，两组比较均有统计学意义(P＜0.01)见图 3、4。

图3 两组组织中CTGF蛋白Western blot检测结果

图4 CTGF蛋白在两组组织中的表达变化

3 讨论

尿道下裂的病因比较复杂，涉及遗传、激素和环境等因素，在尿道下裂发生的危险因素中妊娠早期母体(被动)吸烟、接触农药杀虫剂、胎儿低出生体质量可能增加胎儿尿道下裂的发生风险[2]。目前有学者研究发现，在孕期给母鼠一定的雌激素干预，可以诱导雄性胎鼠发生先天性尿道下裂[3]，为雌激素或抗雄激素物质是导致尿道下裂的一个重要环境因素的假说提供了理论支持。CTGF为雌激素反应基因，是TGF-β信号通路中重要组成部分，在孕期其转录可被雌激素调节[4，5]，而TGF-β信号可参与生殖结节的发育[6]。在病理状况下CTGF过度表达时可以直接作用于间充质来源细胞(如成纤维细胞)，促进其增殖，还能作为TGF-β的下游蛋白介导其促纤维化作用，而且TGF-β已被证实是炎性组织形成及不同组织中纤维化发生的关键介导因子[7]。李世荣等[8]发现体外培养的人增生性炎性组织成纤维细胞与正常皮肤细胞相比，胶原合成、CTGF基因及CTGF蛋白表达均显著增高。CTGF受到多种细胞因子诱导表达，如血管紧张素Ⅱ、HGF、TGF-β1等。在成纤维细胞中，CTGF启动子含有TGF-β应答元件，可被TGF-β1选择性诱导激活[9]。Twigg SM等[10]研究发现在人成纤维细胞中，重组CTGF可诱导纤维连接蛋白mRNA的表达和蛋白的合成，作用效果呈剂量依赖性，CTGF中和性抗体可以显著降低但不能完全抑制这种作用。Fan WH等[11]在体外实验中发现，如果CTGF过度表达，血管平滑肌细胞的迁移率和生长率都将有显著增加，CTGF中和性抗体可逆转此作用。

本研究结果显示，阴茎体型及会阴型尿道下裂患者包皮组织中CTGFmRNA和CTGF蛋白的表达均较正常人显著升高。我们推测CTGF所涉及的转录调控和尿道下裂的发生有关，CTGF可能是尿道下裂中的一个关键调控基因。最近周娟等[12]研究发现尿道下裂和CTGF基因相关，也进一步证实雌激素可能通过上调CTGF的表达参与调节生殖结节的异常发育，导致尿道下裂。

在尿道形成过程中，CTGF是否干扰了泌尿生殖细胞的分化和转化有待于深入研究。目前，有关散发的单纯性尿道下裂的研究不多，本实验初步证实了结缔组织生长因子(CTGF)和散发的单纯性尿道下裂相关，CTGF有可能通过调控尿道下裂相关基因的表达水平，或通过CTGF相关的信号转导通路，干扰尿道的正常发育而导致尿道下裂。进一步研究尿道下裂中产生CTGF的分子基础或它作用的靶基因，探索CTGF相关信号传导通路，有可能揭示散发的单纯性尿道下裂的发病机制。选择治疗策略阻断CTGF的基因表达，应用CTGF中和抗体或受体拮抗剂来阻断 CTGF信号传导表达和生物学活性，这可能是控制纤维化疾病发生和发展的一种新手段，为今后防治炎性疤痕纤维化疾病带来新的希望。

[1]Wang Z,Liu BC,Lin GT,et al.Up-regulation of estrogen responsive genes in hypospadias:microarray analysis[J].JUrol,2007,177(5):1939-1946.

[2]朱遵伟,孟栋良,张明英,等.尿道下裂发生的危险因素研究[J].南昌大学学报(医学版),2010,50(11):16-18.

[3]Yucel S,Cavalcanti AG,Desouza A,et al.The effect of oestrogen and testosterone on the urethral seam of the developing malemouse genital tubercle[J].BJU Int,2003,92(9):1016-1021.

[4]Hewitt SC,Deroo BJ,Hansen K,et al.Estrogen receptor-dependent genomic responses in the uterusmirror the biphasic physiological response to estrogen[J].Mol Endocrinol,2003,17(10):2070-2083.

[5]Rageh MA,Moussad EE,Wilson AK,et al．Steroidal regulation of connective tissue growth factor (CCN2；CTGF) synthesis in the mouse uterus[J].Mol Pathol,2001,54(5):338-346.

[6]Willingham E,Baskin LS.Candidate genes and their response to environmental agents in the etiology of hypospadias[J]. Nat Clin Pract Urol,2007,4(5):270-279.

[7]Border WA，Noble NA．Transforming growth factor beta in tissue fibrosis[J].N Engl JMed,1994,331(19):1286-1292.

[8]李世荣,刘剑毅,纪淑兴.体外培养人增生性瘢痕成纤维细胞胶原合成及结缔组织生长因子的表达[J].中华整形外科杂志,2004,20(2):124-127.

[9] Grotendorst GR.Connective tissue growth factor:a mediator of TGF-beta action on fibroblasts[J]. Cytokine Growth Factor Rev,1997,8(3):171-179.

[10]Twigg SM,Joly AH,Chen MM,et al.Connective tissue growth factor/IGF-binding protein-related protein-2 is a mediator in the induction of fibronectin by advanced glycosylation end-products in human dermal fibroblasts[J].Endocrinology,2002,143(4):1260-1269.

[11]Fan WH,Pech M,Karnovsky MJ.Connective tissue growth factor(CTGF)stimulates vascular smooth muscle cell growth and migration in vitro[J].Eur JCell Biol,2000,79(12):915-923.

[12]周 娟,王 浩,彭御冰,等.ATF3和CTGF基因在尿道下裂患者包皮中的表达及雌激素调控研究[J].中华男科学杂志,2009,15(12):1075-1080.